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1、一）细胞DNA含量检测细胞固定后用细胞固定后用PI PI（Propidium iodide碘化丙啶），染色，因为染色，因为PIPI特异性结合于细胞特异性结合于细胞DNADNA，荧光强度与，荧光强度与PIPI的结合量呈良好的线性关的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，可测出细胞的系，根据这个原理，可测出细胞的DNADNA含量。用于细胞周期、细含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。胞倍体以及凋亡的检测。第1页/共26页第2页/共26页单参数直方图图中2N代表G0/G1期细胞，4N代表G2/M期细胞，两者中间代表S期细胞。这是以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图 第3页/共26页DNA细胞
2、周期分析细胞周期G2MGG0 0GG1 1s 200 400 600 8001000GG0 0GG1 1sG2MDNADNA分析分析DNA含量细胞数量2N2N4N4N第4页/共26页第5页/共26页2倍体异倍体4倍体肿瘤组织中的各种DNA倍体第6页/共26页含量与凋亡关系DNA亚G1峰的检测：利用PI染色，检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将DNA降解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量减少，成为亚2倍体。第7页/共26页第8页/共26页第9页/共26页2.
3、凋亡研究凋亡研究在在 G0/G1峰峰 前前 出出 现现一一个个亚亚二二倍倍体体峰峰，即凋亡峰。即凋亡峰。检检测测调调亡亡，可可进进行行抗抗肿肿瘤瘤药药物物研研究究和和某某些些因因素素对对细细胞胞的的损伤机理的研究。损伤机理的研究。第10页/共26页第11页/共26页Annexin V Assay第12页/共26页图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死第13页/共26页Date acquired:14-Jan-03Source:dongboDIPLOID:100.00%图 FCM测试细胞周 期分布和凋亡第14页/共26页根据凋亡细胞的特点来检测在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在
4、核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏凋亡细胞的凋亡细胞的FSC？SSC？细胞坏死时，细胞肿胀，细胞坏死时，细胞肿胀，FSC？，？，SSC？第15页/共26页正常人静止体细胞有46条染色体，相当于7.10-12 pg DNA/细胞核，我们称之为二倍体细胞，而正常增殖细胞则存在不同的DNA含量。在细胞周期(G0，G1，S，G2，M)的各个时期，DNA含量随各时相呈现出周期性的变化：在G1期，细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体；第16页/共26页进入S期后，DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1
5、和G2期之间；当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期，G2期细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期，因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期；一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个子细胞，这两个子细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期(G0期)，而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此，整个复制周期可以描述为G0/G1，S，G2/M期。第17页/共26页第18页/共26页通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1，S及G2/M的百分含量，了解细胞的增殖能力；结合DNA指数分析，还可进行凋亡、异倍体等检测。第19页/共26页G
6、2MGG0 0GG1 1s0 200 400 600 8001000GG0 0GG1 1sG2MDNA AnalysisDNA AnalysisDNA contentCount2N2N4N4NNormal Cell Cycle 第20页/共26页细胞浓度及质量要求细胞浓度及质量要求单细胞和核的上机浓度应约106/ml。浓度太低，上机时样本的流速不得不提高，这样就会影响检测的CV。浓度太高，则可能导致染料的相对不足，最终使染色不饱和，同样影响CV和检测结果。制备完成后的标本应用光学显微镜检查其质量：细胞是否聚集或过多的碎片。第21页/共26页染料的选择取决于流式激光的配置。488nm的激光下应用
7、PI(碘化丙啶)，由于PI也与RNA结合，所以分析前样本应用Rnase处理.。重要的是染料要足够，以保证饱和结合。PI的推荐浓度是至少20ug/106 个细胞。其最佳浓度为50ug/106 个细胞。第22页/共26页操作步骤 取一瓶生长期的A549细胞，倒掉瓶中旧的培养液，加入3mlPBS，细胞生长面在下轻轻晃动细胞瓶，然后去掉液体，加入1ml胰蛋白酶消化15分钟（以镜下观察决定）加入5mlPBS轻轻吹打细胞生长面，制成细胞悬液，将细胞悬液移至15ml离心管中1500rpm离心5min，去上清。加入500ulPBS轻轻吹打细胞团成细胞悬液，在旋涡状态下逐滴加入2ml-2095%冷乙醇，混匀后固定30min。第23页/共26页加入5mlPBS，1500rpm离心5min，去上清液。加入5mlPBS重悬细胞，1500rpm离心5min，去上清液。加入800ulPI染液，用枪轻轻吹打细胞团，混匀，室温避光染色30min上机检测。第24页/共26页影响荧光染色的因素 温度：温度高于20时，即出现温度淬灭。2、PH：PI在7.27.6，保持荧光染料分子与溶剂间的电离平衡。3、荧光染料浓度：染料太少，结合不完全。染料过多，又会出现浓度淬灭现象。4、固定剂：醛类固定剂会干扰插入性染料与核酸分子的结合，造成荧光发射强度减弱。第25页/共26页感谢您的观看！第26页/共26页