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1、远源杂交远源杂交远缘杂交：不同种属之间，或是地理上远缘的种内亚种之间个体的交配称为远缘杂交。由于种属间存在着种种隔离机制，致使远缘杂交常表现不亲和或获得的远缘杂种表现不育。第1页/共40页不亲和性不亲和性：在有性生殖过程中，由于个体细胞或在有性生殖过程中，由于个体细胞或组织水平上的组织水平上的不协调不协调而使而使受精或接合不能正常进受精或接合不能正常进行行，或是，或是受精后不能产生后代受精后不能产生后代的现象。的现象。双亲个体间基因型的双亲个体间基因型的不协调或是染色体组非同源不协调或是染色体组非同源性性在生殖生理表型上的一种反映。不亲和性是在生殖生理表型上的一种反映。不亲和性是稳稳定物种定物
2、种的重要机理。的重要机理。种间不亲和性种间不亲和性：异种、异属生物个体之间的生殖异种、异属生物个体之间的生殖不亲和现象常由不亲和现象常由染色体组的不同染色体组的不同所造成。一般地所造成。一般地说，越是说，越是远缘则不亲和性越高远缘则不亲和性越高，直到完全不能受，直到完全不能受精。精。第2页/共40页第六章 细胞杂交（融合）技术 一、定义1，细胞融合(cell fusion)广义：凡是将两个细胞或原生质体融合成一个细胞的过程。包括体细胞、性细胞的融合和自发融合。就植物而言，又称为原生质体融合(protoplast fusion)。狭义：狭义：将不同的体细胞融合在一起，通过对杂种细胞的筛选，培养，
3、期望得到体细胞杂种的一种手段。所以又称为体细胞杂交(somatic hybridazation)。细胞融合=原生质体融合=体细胞杂交第3页/共40页第4页/共40页体细胞杂交与有性杂交的异同体细胞杂交与有性杂交的异同比较内容体细胞杂交有性杂交时间无季节限制花期限制，特别是母本的花期亲缘关系一定程度上可以克服有性/嫁接不亲和性受亲和性影响结果细胞核、细胞质均可以重组、倍性增加双受精，一般无细胞质重组，倍性不改变第5页/共40页 第二节第二节 体细胞杂交步骤：体细胞杂交步骤：1 原生质体的制备2 原生质体的融合3 杂种细胞选择4 杂种细胞培养5 由愈伤组织再生植株6 杂种植株的鉴定第6页/共40页
4、原生质体融合原生质体融合自发融合自发融合：自然界中：受精、双受精、花粉母细胞融合等。自然界中：受精、双受精、花粉母细胞融合等。在原生质体制备和培养过程中：细胞壁被分解后，原生质体的胞间连丝发生膨大，相邻在原生质体制备和培养过程中：细胞壁被分解后，原生质体的胞间连丝发生膨大，相邻细胞的原生质和细胞器通过胞间连丝流到一起，形成融合。此现象在细胞的原生质和细胞器通过胞间连丝流到一起，形成融合。此现象在同种或同品种同种或同品种植物植物间发生间发生,但但频率极低频率极低。第7页/共40页诱导融合：通过诱导剂的作用，使两个远缘的原生质体产生融合的方法，是细胞融合中常用的手段第8页/共40页细胞融合的方法细
5、胞融合的方法聚乙二醇 PEG）化学方法化学方法电脉冲物理方法物理方法生物方法生物方法仙台病毒(Sendai virus)NaNO3处理高PH-高浓度Ga2+第9页/共40页 NaNO3处理 1909年，Kuster在一个发生了质壁分离的表皮细胞中，低渗NaNO3溶液可以引起2个亚原生质体的融合。缺点：异核体形成频率不高，对细胞毒害大，融合率低(0.1%)，重复难。第10页/共40页 高PH-高浓度钙离子处理 1973年，Keller和Melchers，用强碱性(pH10.5)的高浓度钙离子（50mmol.L-1)溶液在37下处理约30min，两个品系的烟草叶肉原生质体很容易融合。但对于有些原生
6、质体系统，这样高的PH值是有毒的。第11页/共40页 PEG(聚乙二醇)处理 PEG的作用机理：由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合。另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。第12页/共40页第13页/共40页PEGPEG融合所需试剂融合所需试剂融合液：pH 5.6CaCl2 8-10mmolKH2PO4 0.7mmol甘露醇或山梨醇 0.5-1.0mol诱导液：融合液PEG 2045第14页/共40页PEG作为融合剂的优点:异
7、核体形成的频率高，可重复性强。缺点：有一定毒性，容易形成多个细胞的融合体；分裂频率低。第15页/共40页 电 融 合 电场来诱导细胞彼此连接成串，再施加电场来诱导细胞彼此连接成串，再施加瞬间强脉冲瞬间强脉冲促使质膜发生可逆性电击穿，促促使质膜发生可逆性电击穿，促进细胞融合的技术。进细胞融合的技术。原理：原理：在直流电脉冲的刺激下，原生质体质膜表面的电荷发生改变，使异种细胞或原在直流电脉冲的刺激下，原生质体质膜表面的电荷发生改变，使异种细胞或原生质体粘合并发生生质体粘合并发生质膜瞬间破裂质膜瞬间破裂，进而连接，直到闭合成完整的膜形成融合体。，进而连接，直到闭合成完整的膜形成融合体。优点优点：融合
8、率高、重复性与可控制性强。：融合率高、重复性与可控制性强。缺点缺点：可能会造成不可恢复的细胞损伤。：可能会造成不可恢复的细胞损伤。第16页/共40页 细胞电融合仪第17页/共40页第18页/共40页第19页/共40页第20页/共40页 生物法病毒诱导细胞融合：研究最早的细胞融合诱导方法。主要是由于病毒会与宿主细胞膜直接融合，同时进入两个细胞就会打破两个细胞膜的隔阂，引发细胞质的交流，进而达到细胞融合的目的。缺点：要提前大量培养病毒，并且灭活后才能作为融合剂使用，操作繁琐，而且一旦灭活不充分的话，病毒还可能感染亲本细胞。因此，目前已经很少使用病毒诱导法进行细胞融合。第21页/共40页（1）足够量
9、的病毒颗粒附着在细胞膜上起搭桥作用，使细胞聚集在一起。（2）通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相融合。粘结部位质膜被破坏，不同细胞间形成通道，细胞质流通并融合（病毒也随之进入细胞质）。（3）有丝分裂，细胞核融合，形成杂种细胞。第22页/共40页原生质体的融合过程原生质体的融合过程 异种原生质体先经异种原生质体先经膜融合膜融合形成共同的形成共同的质膜质膜，然后经，然后经胞质融合胞质融合，产生，产生细胞壁细胞壁，最，最后是后是核融合核融合。细胞核的融合是异种原生质细胞核的融合是异种原生质体融合的关键。体融合的关键。融合体只有成为单核细胞后才能继续生长融合体只有成为单核细
10、胞后才能继续生长，才能合成才能合成DNADNA、RNARNA，第23页/共40页四 异核体的核融合异核体的核融合 取决于二亲本原生质体取决于二亲本原生质体发育周期的同步发育周期的同步程度和系统程度和系统发育关系的远近以及培养基对二亲本原生质体的有利发育关系的远近以及培养基对二亲本原生质体的有利程度程度1 1 异核体的核融合和染色体的行为异核体的核融合和染色体的行为 一般是在两亲本核同步分裂过程中发生的。第一一般是在两亲本核同步分裂过程中发生的。第一次次有丝分裂有丝分裂；这就要求两个核必须同步分裂，如；这就要求两个核必须同步分裂，如果两个核所处时期不同，一个开始合成果两个核所处时期不同，一个开始
11、合成DNADNA，另另一个还处于合成的中途或已完成了复制，它们之一个还处于合成的中途或已完成了复制，它们之间就会相互影响，导致最终不能进行细胞分裂。间就会相互影响，导致最终不能进行细胞分裂。2 2 亲缘关系对融合体发育的影响亲缘关系对融合体发育的影响种内和亲和的种间：种内和亲和的种间：不亲和属间、科间：不亲和属间、科间：第24页/共40页核核融融合合失失败败，染染色色体体丢丢失失、重重排排或或形形成成嵌嵌合合体体。即即使使属属间间能能发发育育成成植植株株，也也是是不不育育的的。海海藻藻+胡胡萝萝卜卜，在在第第一一次次分分裂裂后后，一一亲亲本本核核即即退退化化。H He el la a+胡胡萝萝
12、卜卜，胡胡萝萝卜卜核核退退化化。第25页/共40页细胞融合是一个随机的物理过程，经融合后细胞将以多种形式出现，需要通过培养和筛选，除去不需要的细胞，分离出需要的杂种细胞，从而解决融合细胞的选择问题。问题：A与B融合过程中，有哪些形式的细胞吗？第26页/共40页选择融合体或杂种细胞选择融合体或杂种细胞1.1.互补选择法互补选择法2.机械分离杂种细胞法3.双荧光标记选择法第27页/共40页异硫氰酸荧光素（FITC）：绿色异硫氰酸罗丹明（RITC）：红色双荧光标记选择法双荧光标记选择法第28页/共40页体细胞杂种植株的鉴定 形态学鉴定 细胞学观察 分子标记 同工酶分析第29页/共40页 形态标记形态
13、标记 形态标记即植物的外部特征，如花的形状及颜色、耐逆性以及对病的抗性等。形态标记简单直观，但是标记少、多态性差、易受环境条件和其它修饰基因的影响，并且许多性状为数量性状，由几个位点控制，表现为一个范围，而不是简单的性状差异。第30页/共40页细胞学标记细胞学标记 细胞标记主要包括染色体核型(染色体数目、大小、随体、着丝点位置等)和带型(C带、N带、G带等)。细胞学标记位点较少，而且对于亲缘关系较近的物种，由于细胞学标记差别不明显，所以很难根据细胞学特征来区分。第31页/共40页荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISH）优点是可以显示在体细胞杂种中哪条染色体来源于这个亲本，哪条染色体来源于另一个亲
14、本，因而更准确、直观。第32页/共40页分子生物学标记分子生物学标记植物的分子标记主要有RAPD、RFLP、AFLP、SSR、ISSR、EST等。第33页/共40页第34页/共40页第35页/共40页体细胞杂交育种的体细胞杂交育种的意义意义1 1 克服有性不亲和性，实现远源遗传重组，创造新克服有性不亲和性，实现远源遗传重组，创造新的物种或品系。的物种或品系。细胞融合产生的后代细胞融合产生的后代 种内（稳定）种内（稳定）种间（稳定或不稳定）种间（稳定或不稳定）属间（不稳定），番茄属间（不稳定），番茄+土豆土豆 =Potamato =Potamato 科间（不稳定，无植株），科间（不稳定，无植株），门间（不稳定，无植株）门间（不稳定，无植株）第36页/共40页问题：与基因工程改造相比有什么优点？思考题第37页/共40页人们可以随心所欲地将各个物种细胞人们可以随心所欲地将各个物种细胞融合形成新的生命形式吗？融合形成新的生命形式吗？第38页/共40页 第39页/共40页40感谢您的观看！第40页/共40页