细胞凋亡及机制检测.pptx

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1、危难中的细胞啊，你沉稳不乱，DNA片片切割，化云梯直通天堂；细胞体分团相聚，把生命的凝重浓集在小体上；分别了朝夕相处的伙伴，再见了快乐美好的时光；这一切的一切又融入临近的胞体，腾出的空间再写生命的篇章。第1页/共71页第2页/共71页第3页/共71页典型的凋亡小体（apoposis boby）：由透亮空泡和不由透亮空泡和不透光的浓密的核碎片两部透光的浓密的核碎片两部分组成。分组成。第4页/共71页第5页/共71页第6页/共71页 坏死坏死 凋亡凋亡1.性质性质病理性病理性,非特异性非特异性生理性或病理性，特异性生理性或病理性，特异性2.诱导因素诱导因素 强烈病理性刺激强烈病理性刺激,随机发生随

2、机发生生理性或较弱病理性刺激，非随机发生理性或较弱病理性刺激，非随机发生生3.生化特点生化特点 被动过程被动过程,无新蛋白合成无新蛋白合成,不不耗能耗能耗能的主动过程，有新蛋白合成耗能的主动过程，有新蛋白合成4.形态变化形态变化 细胞结构全面溶解、破坏、细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀细胞肿胀胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩固缩,膜可发泡成芽膜可发泡成芽,形成凋亡小体形成凋亡小体5.DNA电泳电泳弥散性降解，电泳呈均一弥散性降解，电泳呈均一DNA片状片状DNA片段化（片段化（180-120bp）,电泳呈电泳呈“梯梯”状条带状条带6.炎症反应炎症反应 溶酶体破

3、裂，局部炎症反应溶酶体破裂，局部炎症反应 溶酶体相对完整，局部无炎症反应溶酶体相对完整，局部无炎症反应7.凋亡小体凋亡小体无无有有8.基因调控基因调控无无有有细胞凋亡与坏死的比较第7页/共71页2002年10月7日英国人悉尼布雷诺尔、美国人罗伯特霍维茨和英国人约翰苏尔斯顿，因在细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔生理与医学奖。Sydney BrennerH.Robert HorvitzJohn E.Sulston 第8页/共71页细胞凋亡与疾病发生机制的新认识新认识1.该“死”的细胞（如肿瘤细胞、自身反应性免疫细胞）未死，是造成肿瘤、自身免疫性疾病的主要发病机制之一。细胞凋亡不足2.不该“死”的细

4、胞（如神经元、心肌细胞）死了，这与老年性痴呆、心肌缺血/再灌注损伤等发病有关。细胞凋亡过度第9页/共71页胸腺细胞正常凋亡第10页/共71页胸腺细胞正常凋亡第11页/共71页细胞凋亡的过程细胞凋亡的过程1.凋亡信号转导2.凋亡基因激活3.细胞凋亡的执行4.凋亡细胞的清除第12页/共71页凋亡过程及分期诱导期 执行期 消亡期 凋亡诱导因素受体cAMPCa2+神经酰胺死亡信号凋亡相关基因激活Dnase激活Capases激活巨噬细胞吞噬细胞凋亡细胞第13页/共71页细胞凋亡的生化改变细胞凋亡的生化改变1.DNA的片段化“梯”状条带2.内源性核酸内切酶激活及其作用3.凋亡蛋白酶（caspases）的激

5、活 及其作用第14页/共71页1.DNA的片段化“梯”状条带为细胞凋亡主要特征几乎所有凋亡细胞均有核小体间的裂 解，导致DNA 的断裂；DNA降解过程的特异性：不伴有组蛋 白和其它核蛋白的降解；染色质在核小体间的裂解是凋亡细胞 和形态改变的基础；DNA fragmentation是凋亡的“golden marker”。第15页/共71页第16页/共71页2.2.内源性核酸内切酶激活及其作用内源性核酸内切酶激活及其作用由一系列胞内信号转导环节激活，由一系列胞内信号转导环节激活，执行染色质执行染色质DNADNA切割切割第17页/共71页3.Caspase 9 激活，需要通过CARD（caspase

6、-recruitment domain)、Apaf-1、细胞色素c、ATP等多个因子的参与Caspases在凋亡中的主要作用1.灭活细胞凋亡的抑制物（如细胞凋亡的抑制物（如Bcl-2Bcl-2）；）；2.2.水解水解细胞的蛋白质结构，细胞的蛋白质结构，导致细胞解体，形成导致细胞解体，形成凋亡小体（apoposis boby）；3.在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白，使该蛋白获得或丧失某种生物学功能第18页/共71页细胞凋亡的调控细胞凋亡的调控（一）细胞凋亡相关因素1.诱导性因素2.抑制性因素(二)细胞凋亡信号的转导第19页/共71页1.细胞凋亡的诱导因素.生理活性因子：TNF家族(Fas-L,T

7、NF)、TGF、神经递质(谷氨酸、多巴胺)、生长 因子撤退、GC等.损伤相关因子：热休克、病毒感染、自由基、癌基因、抑癌基因、放射线等.化疗药物.毒素：乙醇、-淀粉样肽第20页/共71页2.细胞凋亡的抑制因素.凋亡相关基因的抑制作用：p53、bcl-2、bcl-XL等。.生理性抑制剂：生长因子、细胞外基质、锌、雄激素、雌激素等.病毒基因：腺病毒E1B、杆状病毒p35、棒状病毒IAP、牛痘病毒CrmA、EBV BHRF1等.药物：Calpain抑制剂、caspases抑制剂、促癌剂、佛波豆蔻乙脂(PMA)等第21页/共71页(二)细胞凋亡信号的转导凋亡信号转导系统特点凋亡信号转导系统特点 多样性

8、：不同种类的细胞系统不同多样性：不同种类的细胞系统不同 偶联性：与增殖分化的信号系统交叉偶联偶联性：与增殖分化的信号系统交叉偶联 同一性：多因素，共用同一系统触发同一性：多因素，共用同一系统触发 多途性：同一诱导因素启动多条信号转导途径多途性：同一诱导因素启动多条信号转导途径第22页/共71页细胞凋亡信号的转导细胞凋亡信号的转导诱导信号cellR神经酰胺多途径RSAPK/JNKP53 基因NF-kB,JNK/AP-1途径激活bax or 下调bcl-2ROSmtDNA第23页/共71页细胞凋亡相关基因细胞凋亡相关基因抑制凋亡基因：抑制凋亡基因：bcl-2bcl-2促进凋亡基因：促进凋亡基因：f

9、asfas，P53P53双向调控基因：双向调控基因：c-mycc-myc，bclxbclx研究较多的有c-myc、bcl-2、p53、Ice、Fas/APO-1等。第24页/共71页1.c-mycc-myc诱导细胞增殖，也能诱导细胞凋亡。当生长因子存在，bcl-2基因表达时，促进细胞增殖，反之细胞凋亡。第25页/共71页第一个被确认有抑制凋亡作用的基因，存在于线粒体外膜、核膜及部分内质网中。bcl-2相当于线虫的ced9。Bcl-2家族可分为两类，一类是抗凋亡的，如：Bcl-2；一类是促进凋亡的，如：Bax、Bad、Bid，以二聚体形体发挥作用。2.bcl-2第26页/共71页Bcl-2Bcl

10、-2抗凋亡机制抗凋亡机制直接的抗氧化直接的抗氧化抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质抑制促凋亡的抑制促凋亡的BaxBax，BakBak细胞毒作用细胞毒作用抑制抑制CaspasesCaspases激活激活维持细胞钙稳态维持细胞钙稳态第27页/共71页3.fas fas又称作APO-1或CD95，属TNF受体和NGF受体家族。对细胞凋亡有促进作用基因产物为45KD的跨膜蛋白。Fas蛋白与Fas配体组成Fas系统，二者的结合导致靶细胞走向凋亡。第28页/共71页与线虫ced-3同源，又称为Caspase。ICE是一种半胱氨酸蛋白酶，在人类，ICE家族至少有11个成员，每一成员均含

11、有与底物结合及催化的保守序列，识别位点在Asp之后，故又称Caspases。启动子Caspases：Caspases8、9和10 效应子Caspases：Caspases3、6、74.ICE蛋白酶家族第29页/共71页5.Apaf-1与线虫的ced-4同源；在线粒体参与的凋亡途径中发挥作用；能激活Caspase3，这一过程需要细胞色素c和Caspase9的参与。第30页/共71页6.p53 磷酸化p53使细胞处于G1期，必要时诱导细胞凋亡。p21 CDK RB不被磷酸化 G1DNA损伤 p53 并磷酸化 Bax ,Bcl apoptosis Gadd45 DNA修复野生型P53基因具有诱导细胞

12、凋亡的功能“分子警察”；第31页/共71页细胞凋亡发生机制细胞凋亡发生机制（一）氧化损伤（二）钙稳态失衡 (三)线粒体损伤第32页/共71页（一）氧化损伤机制氧自由基可破坏机体正常的氧化/还原的动态平衡，造成生物大分子的氧化损伤，干扰正常的生命活动，形成严重的氧化应激状态后果：诱导细胞凋亡。第33页/共71页氧化应激引起细胞凋亡的可能机制1.氧自由基引起的DNA损伤可激活P53基因引起细胞凋亡。2.氧自由基引起的DNA损伤可活化多聚ADP核糖合成酶，引起NAD快速耗竭，ATP大量消耗，引发细胞凋亡。3.氧自由在攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸，通过脂质过氧化作用直接造成细胞膜的损伤可诱导细胞凋亡；此

13、外细胞膜上不饱和脂肪酸（如：花生四烯酸）的氧化产物过氧羟基24碳四烯酸有很强的诱发细胞凋亡的作用。第34页/共71页氧化应激引起细胞凋亡的可能机制（续）4.氧化应激可激活Ca2+/Mg2+依赖的DNase，也可产生膜的发泡现象。5.氧化应激引起细胞膜结构的破坏，可改变细胞膜的通透性使Ca2+内流增加，诱导细胞凋亡。自由基对线粒体膜的损害导致其通透性和膜电位的变化也可诱导细胞凋亡。6.氧化应激可活化核转录因子NF-B、AP-1，可加速细胞凋亡相关的一些基因的表达，诱发细胞凋亡。第35页/共71页（二）钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制1.激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶(DNase)，降解D

14、NA链；2.激活谷氨酰胺转移酶，催化细胞内肽链间的酰基转移，在肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成；3.激活核转录因子，加速细胞凋亡相关基因的转录；4.Ca2+在ATP的配合下使DNA链舒展，暴露出核小体之间的连接区内的酶切位点，有利于DNA内切酶切割DNA。第36页/共71页(三)线粒体损伤第37页/共71页第38页/共71页细胞凋亡的恶性网络假说细胞凋亡的恶性网络假说线粒体 m PTP开放 Apaf+Cyt.C AIFCaspase抑制剂+Caspase 9酶原Caspase-9Caspase3酶原Caspase-3蛋白质水解无活性核酸内切酶内切酶激活DN

15、A断裂+Bcl-2Ca2+apoptosis？第39页/共71页氧化损伤钙稳态失衡线粒体损伤恶性网络假说(deleterious network hypothesis)细胞凋亡 m AIF，ApafPTP open第40页/共71页细胞凋亡的生物学意义细胞凋亡的生物学意义1.1.发育发育 从低等动物到高等动物的发育，都存从低等动物到高等动物的发育，都存在着程序性细胞死亡的现象。在着程序性细胞死亡的现象。2.2.免疫系统免疫系统 淋巴细胞发育分化成熟过程中，淋巴细胞发育分化成熟过程中，始终伴随着细胞凋亡。始终伴随着细胞凋亡。3.3.衰老衰老 细胞凋亡与许多年龄相关疾病有直接细胞凋亡与许多年龄相关

16、疾病有直接或间接的联系。或间接的联系。4.4.损伤与修复损伤与修复 5.5.肿瘤发生肿瘤发生 细胞增殖与死亡的速度平衡失调。细胞增殖与死亡的速度平衡失调。6.6.病毒致病病毒致病 病毒表达抗凋亡蛋白。病毒表达抗凋亡蛋白。第41页/共71页Hutchinson-Gilford syndrome 第42页/共71页第43页/共71页细胞凋亡与疾病（一）细胞凋亡不足1.肿瘤2.自身免疫病第44页/共71页 1.凋亡与恶性肿瘤凋亡与恶性肿瘤 肿瘤的发生不仅与细胞过度增殖有关，肿瘤的发生不仅与细胞过度增殖有关，还与凋亡障碍有关。还与凋亡障碍有关。Oncogenes “anti-apoptic”genes

17、 Cell division cell death 肿瘤治疗新思路：诱导肿瘤细胞的凋亡肿瘤治疗新思路：诱导肿瘤细胞的凋亡第45页/共71页 2.凋亡与免疫系统功能障碍凋亡与免疫系统功能障碍 凋亡对免疫系统功能有重要调节作用凋亡对免疫系统功能有重要调节作用 淋巴细胞：在发育过程中有凋亡发生；淋巴细胞：在发育过程中有凋亡发生；在晚期，当与抗原相互作用时亦发生凋在晚期，当与抗原相互作用时亦发生凋亡。亡。胸腺发育过程中的自然凋亡过程胸腺发育过程中的自然凋亡过程第46页/共71页（二）细胞凋亡过度（二）细胞凋亡过度1.心血管疾病（1）心肌缺血 与缺血-再灌注损伤（2）心力衰竭第47页/共71页（1）心肌

18、缺血和再灌注损伤）心肌缺血和再灌注损伤 心肌缺血再灌注后可引起心肌细胞心肌缺血再灌注后可引起心肌细胞的凋亡，由于心肌组织中吞噬细胞数量的凋亡，由于心肌组织中吞噬细胞数量有限，故而凋亡细胞可以激发性引起炎有限，故而凋亡细胞可以激发性引起炎性反应，招引中性粒细胞浸润，进而导性反应，招引中性粒细胞浸润，进而导致心肌组织坏死（心肌梗塞）。致心肌组织坏死（心肌梗塞）。第48页/共71页 (2)凋亡与心脏病凋亡与心脏病 心脏传导障碍和心律失常心脏传导障碍和心律失常 心脏传导系统在胚胎早期就已形成。心脏传导系统在胚胎早期就已形成。新生儿窦房结主要有大量起搏细胞（新生儿窦房结主要有大量起搏细胞（P细细胞）和少

19、量胶原组成，而成人则为少量胞）和少量胶原组成，而成人则为少量P细胞和大量胶原构成，可能是细胞和大量胶原构成，可能是P细胞凋亡细胞凋亡的结果。因此的结果。因此P细胞凋亡不足或过度均可细胞凋亡不足或过度均可引起心律失常。引起心律失常。第49页/共71页2.神经元退性疾病神经元退性疾病（1）阿尔茨海默病(AD)（2）帕金森病（3）多发性硬化症第50页/共71页(1)凋亡与神经退行性病变凋亡与神经退行性病变 神经元是神经元是non-proliferating,long-lived,terminally differentiated cell。神经元等非增殖细胞发生凋亡的意义：神经元等非增殖细胞发生凋亡

20、的意义：1、避免细胞重新进入细胞周期，特别是遇、避免细胞重新进入细胞周期，特别是遇 到致转化刺激信号时。如向终末分化的到致转化刺激信号时。如向终末分化的 细胞中转染细胞中转染oncogene可引起细胞凋亡，可引起细胞凋亡，而非增殖。而非增殖。第51页/共71页(2)(2)为了器官生存的需要为了器官生存的需要 A deleted cell is more advantageous than a damaged cell,even when the cell is irreplaceable.This is analogous to what is frequently referred to a

21、s“better dead than wrong”for dividing cell第52页/共71页 3.病毒感染 人免疫缺陷病毒（HIV）感染引起的AIDS第53页/共71页(凋亡与免疫缺陷性疾病凋亡与免疫缺陷性疾病)典型例子是典型例子是AIDS1.HIV-1感染后可引起感染后可引起CD4+T淋巴细胞的淋巴细胞的 凋亡，且可能由病毒被膜蛋白复合体凋亡，且可能由病毒被膜蛋白复合体 gp120介导。介导。2.AIDS患者外周血淋巴细胞患者外周血淋巴细胞Fas/Apo水平水平 明显提高，可迅速诱导细胞凋亡。明显提高，可迅速诱导细胞凋亡。由此，通过控制凋亡过程是否可以预由此，通过控制凋亡过程是否可

22、以预防或延缓防或延缓AIDS的进展。的进展。第54页/共71页（三）细胞凋亡不足与三）细胞凋亡不足与过度并存过度并存动脉粥样硬化即属于这种情况，对内皮细胞而言是凋亡过度，对平滑肌细胞来说则是凋亡不足第55页/共71页细胞凋亡在疾病防治中的意义细胞凋亡在疾病防治中的意义1.合理利用凋亡相关因素2.干预凋亡信号转导3.调节凋亡相关基因4.控制凋亡相关的酶学机制5.防止线粒体跨膜电位的下降第56页/共71页1.1.合理利用凋亡相关因素合理利用凋亡相关因素抑凋亡：抑凋亡：NGFNGF老年性痴呆老年性痴呆急性急性T T细胞白血病：低剂量放射线、细胞白血病：低剂量放射线、TNFTNF 促凋亡：促凋亡：局部

23、肿瘤热疗；高温局部肿瘤热疗；高温4343、30min30min前列腺癌：前列腺癌：去势治疗去势治疗2.2.干预凋亡信号转导FAS/FASL信号系统：阿霉素刺激SPP（神经酰胺信号系统的代谢产物）：转导增殖信号，拮抗凋亡AIDS，AD第57页/共71页3.调节凋亡相关基因野生型P53基因转染4.控制凋亡相关的酶核酸内切酶：Ca 2+/Mg 2+依赖性Ca 2+Mg 2+激活；Zn 2+抑制Caspases:Ca2+直接或间接激活5.防止线粒体跨膜电位的下降环胞霉素A(cyclosporinA,免疫抑制剂）阻抑 m，其衍生物无免疫抑制作用，但有稳定 m 第58页/共71页细胞凋亡的检测 随着研究技

24、术的提高和对凋亡的认识不断深入，检测凋亡的方法已从细胞、随着研究技术的提高和对凋亡的认识不断深入，检测凋亡的方法已从细胞、染色质到分子水平日趋完善和成熟。染色质到分子水平日趋完善和成熟。1.1.形态学检测形态学检测2.DNA2.DNA降解分析降解分析3.3.凋亡酶学分析凋亡酶学分析4.4.凋亡相关蛋白分析凋亡相关蛋白分析5.5.流式细胞分析流式细胞分析第59页/共71页一细胞凋亡的形态学分析 细胞凋亡的形态学变化主要表现为：细胞皱缩(cell shrinkage)，失去细胞连接(cell junction)，微绒毛(microvilli)消失，发泡(blebbing)，染色质浓集并靠近核膜，形

25、成沿核膜收缩的新月状体(crescents)，形成凋亡小体(apoptotic body)等。第60页/共71页细胞凋亡的形态学检测方法 检测方法检测方法 可鉴定凋亡细胞特征可鉴定凋亡细胞特征 光学显微镜光学显微镜 相差显微镜相差显微镜 透射电镜透射电镜 聚焦激光扫聚焦激光扫 描电镜描电镜 扫描电镜扫描电镜 流式细胞仪流式细胞仪 缩时摄影术缩时摄影术细胞体积缩小、核浓缩、细胞周围透明圈细胞体积缩小、核浓缩、细胞周围透明圈细胞发泡、凋亡小体细胞发泡、凋亡小体微绒毛消失、染色质沿核膜分布、新月体状核、微绒毛消失、染色质沿核膜分布、新月体状核、凋亡小体凋亡小体凋亡细胞内固缩染色质及核碎片定位凋亡细胞

26、内固缩染色质及核碎片定位细胞膜表面泡状鼓起细胞膜表面泡状鼓起低前向散射光低前向散射光(FSC)、高侧向散射光、高侧向散射光(SSC)凋亡细胞的形成过程凋亡细胞的形成过程第61页/共71页二.DNA降解分析DNA降解过程的特点：1.发生于凋亡早期，由内源性核酸内切酶激活引起2.DNA在核小体连接部位断裂，产生180200bp为最小单位的单体或寡聚体片断3.DNA碎片可被细胞膜包裹，形成凋亡小体第62页/共71页(一)DNA凝胶电泳 原理：凋亡细胞降解产生一系列规则的DNA片断，其电泳结果呈典型的“梯状带”(ladder)；而坏死或凋亡后坏死细胞的DNA分解是随机的，产生的碎片分子量大小不一，在电

27、泳时形成“涂片状”(smear)。普通琼脂糖凝胶电泳、Southern blotting、放射自显影(32PdATP或32PdCTP连接到DNA片断的3 端)第63页/共71页(二)原位标记法TUNEL(TdT mediated dUTP nick end labeling)终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记技术。原理：在TdT的作用下，带有标记物的dUTP被连接在断裂DNA3末端，然后通过相应的方法检测标记物，从而判断是否有凋亡发生。应用范围：石蜡包埋的组织切片、冰冻组织切片、培养细胞、组织中分离的细胞 第64页/共71页(三)ELISA法 原理：以抗组蛋白抗体包被微孔板壁，加入

28、标本，凋亡细胞的核小体可与抗体结合，再加入抗-DNA片断-POD复合物，与核小体中的DNA片断结合，最后加入POD显色底物，以酶标仪测定光密度以进行定量分析。第65页/共71页三.凋亡酶学分析1.内切核酸酶(endonuclease,DNase)种类：DNase （内质网、高尔基体),DNase（溶酶体、胞核)，NUC18（胞核，胸腺细胞中)等 作用：使DNA断裂成180200bp或其倍数的片断 激活机制：CAD(caspase-activate DNase)ICAD(inhibtor of CAD)检测：Western Blotting第66页/共71页Caspases的检测 1.Caspa

29、se-3活性测定(FIENA法)荧光测定免疫吸附法(flurometric immunosorbent enzyme assay,FIENA),caspase-3可作用于连接荧光素的特异底物乙酰化天冬氨酸-谷氨酸-颉氨酸-天冬氨酰胺(Ac-DEVD),产生发荧光的裂解产物AFC，且caspase-3活性与Ac-DEVD-AFC分解的量或自由荧光AFC产生荧光的强弱成正比，故可定量检测 2.蛋白印迹法 Caspases作用底物的检测 PARP89kD的检测第67页/共71页四.凋亡相关蛋白分析1.Bcl-2家族 促进凋亡：Bax,Bal,Bcl-Xs,Bad,Bid,Bik,Bim,Hrk,Bo

30、k等 抑制凋亡：Bcl-2,Bcl-Xl,Bcl-w,Mcl-1,A1/Bfl-1等 均含有BH(Bcl-2 homology)结构域，通过此结构域以二聚体形式调控凋亡。2.其他相关蛋白 p53,Myc,Fas等 第68页/共71页五、流式细胞分析五、流式细胞分析（Flow Cytometry，FCM）利用流式细胞仪对处在快速、直利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技特定群体加以分选的现代细胞分析技术。术。第69页/共71页FCM分析细胞凋亡的方法一.细胞形态分析二.细胞膜结构与功能改变分析三.细胞DNA含量分析四.TUNEL法第70页/共71页感谢您的观看！第71页/共71页