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1、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳第1页/共32页一、一、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验操作及注意事项实验操作及注意事项 第2页/共32页实验分组（每人做一管，每组配一份胶）实验分组（每人做一管，每组配一份胶）认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）封管封管分离胶配制与灌胶（浓度为分离胶配制与灌胶（浓度为6%，化学聚合，每组总体积为，化学聚合，每组总体积为10ml，灌胶高度为，灌胶高度为78cm）封正丁醇封正丁醇3mm（手法、高度、观察界面变化和判断凝固、（手法、高度、观察界面变化和判断凝固、时间掌握时间掌握25min）第3页/共32页注意事项
2、：1、封管要严，防止漏液。2、固定玻璃管要竖直，防止夹碎。3、每组配一份胶，试剂与移液管对号，准确加量。4、配胶后立即灌胶（用滴管灌胶，用后立即清洗）5、正丁醇沿管壁缓缓加入第4页/共32页浓缩胶配制（浓度为浓缩胶配制（浓度为3%3%，光聚合，每组总体积为，光聚合，每组总体积为8ml8ml，灌胶高度为，灌胶高度为1.5cm,1.5cm,留留1cm1cm空隙加样）空隙加样）倒掉正丁醇倒掉正丁醇灌浓缩胶灌浓缩胶 封正丁醇封正丁醇3mm3mm（观察界面，判断凝固时间）（观察界面，判断凝固时间）安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、不漏安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、不漏水、除气泡）水、
3、除气泡）第5页/共32页注意事项：1、倒掉正丁醇，用滤纸吸干再灌浓缩胶。2、配胶后立即灌胶（用滴管）3、灌胶后立即清洗滴管，防止胶凝固于管中。4、撕掉封口膜，用胶塞将玻璃管固定于电泳槽上（竖直，防漏）5、加电极缓冲液（注意液面）第6页/共32页第7页/共32页加加加加bufferbuffer 样品处理并加样（样品处理并加样（样品处理并加样（样品处理并加样（20ul20ul）电泳（电泳（电泳（电泳（6mA/6mA/管，距底管，距底管，距底管，距底1cm1cm时停止）时停止）时停止）时停止）剥剥剥剥胶胶胶胶 固定（时间固定（时间5min5min）染色（时间染色（时间2min2min）漂洗脱色至背景
4、透亮漂洗脱色至背景透亮第8页/共32页 二、电泳基本原理及相关知识二、电泳基本原理及相关知识 第9页/共32页 电泳的概念带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场的作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。广泛应用于生物大分子的分离和鉴定第10页/共32页 电泳的基本原理利用物质的两个差异来分离物质电荷差异电荷差异 电荷性质电荷性质 电荷数量电荷数量分子差异分子差异 分子大小分子大小 分子形状分子形状第11页/共32页 电泳分离蛋白质的原理 蛋白质两性解离与等电点蛋白质两性解离与等电点 溶液溶液pHpH与蛋白质与蛋白质PIPI决定蛋白质电荷性质与数量决定蛋白质电荷性质与数量 不
5、同蛋白质分子大小和分子形状的差异不同蛋白质分子大小和分子形状的差异 第12页/共32页 实验室中常用到的电泳方法 （以介质分类）纸电泳纸电泳 醋酸纤维膜电泳醋酸纤维膜电泳 凝胶电泳凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 第13页/共32页原原 理理聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶是是由由单单体体丙丙烯烯酰酰胺胺(acrylamide(acrylamide，简简称称Acr)Acr)和和交交联联剂剂N,N-N,N-甲甲叉叉双双丙丙烯烯酰酰胺胺(N(N，N Nmethylene-methylene-bisacylamidebisacylamide，简简称称Bis)B
6、is)在在加加速速剂剂N N，N N，N N，N N 四四甲甲基基乙乙二二胺胺(N(N，N N，N N，N N tetramethyl tetramethyl ethylenedia ethylenedia minemine，简简 称称 TEMEDTEMED)和和 催催 化化 剂剂 过过 硫硫 酸酸 铵铵(ammonium(ammonium persulfate persulfate(NH(NH4 4)2 2S S2 2O O8 8，简简称称AP)AP)或或核核黄黄素素(ribofavin(ribofavin即即vita vita min min B B2 2，C C1717H H2020O
7、O6 6N N4 4)的的作作用用下下聚聚合合交交联联成成三三维维网网状状结结构构的的凝凝胶胶，以以此此凝凝胶胶为为支支持持物物的的电电泳泳称称为为聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电 泳泳(polyacrylamide(polyacrylamide gel gel electrophoresiselectrophoresis，简简 称称PAGE)PAGE)。第14页/共32页聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一
8、致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。第15页/共32页凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)蛋白质10420-301-410415-201-5104-110510-1511055-1051052-5核酸(RNA)10415201041055-10105-21062-
9、2.6第16页/共32页聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。第17页/共32页第18页/共32页第19页/共32页第20页/共32页第21页/共32页蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二
10、烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都不一样，约为18A，这样的蛋白质SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原来的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。SDS-PAGE第22页/共32页三、聚丙烯酰胺凝胶电泳三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 第23页/共32页 聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质的原理 不连续聚丙烯酰胺凝胶
11、电不连续聚丙烯酰胺凝胶电 泳泳的三个不连续的三个不连续 聚丙烯酰胺凝胶电泳的三聚丙烯酰胺凝胶电泳的三 个效应个效应 凝胶孔径凝胶孔径缓冲液缓冲液pHpH缓冲液离子成分缓冲液离子成分浓缩效应浓缩效应电荷效应电荷效应分子筛效应分子筛效应第24页/共32页Gly-Pro-Cl-Gly-Pro-Cl-Cl-Cl-Cl-Pro-Pro-Pro-Gly-Gly-Gly-pHpH为为8.98.9的电泳缓冲液的电泳缓冲液（Tris-GlyTris-Gly）pHpH为为6.76.7的浓缩胶的浓缩胶pHpH为为8.38.3的分离胶的分离胶有效泳动率：有效泳动率：MMClCl-MMProPro-MMGlyGly-6
12、%6%胶胶3%3%胶胶第25页/共32页不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。第26页/共32页样品浓缩效应(1)凝胶孔径不连续性：(2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；在pH6.7的凝胶缓冲体系中前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)尾随离子(trai
13、lingion)或慢离子：甘氨酸根(甘氨酸等电点：5.97)mclclmppmGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度)当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；(3)电位梯度的不连续性：分子筛效应电荷效应第27页/共32页四、实验结果的分析四、实验结果的分析 第28页/共32页 相关理论表表-1-1 血清中各蛋白质的相关特性血清中各蛋白质的相关特性种种 类类分子量分子量(万）万）PIPI分分布布(%)(%)清蛋白清蛋白 1-1-球球蛋白蛋白 2-2-球球蛋白蛋白-球球蛋白蛋白-球球蛋白蛋白6.96.95.05.09.09.013.013.011.011.06.16.17.37.36.86.87.67.68.08.055552.130.82.130.84.172.54.172.51.2251.22515.615.6第29页/共32页 前清蛋白前清蛋白 清蛋白清蛋白 2-2-球球蛋白蛋白 1-1-球球蛋白蛋白-球球蛋白蛋白-球球蛋白蛋白第30页/共32页第31页/共32页谢谢您的观看！第32页/共32页