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1、第第4 4章培养条件对发酵的章培养条件对发酵的影响影响-8-84.1 微生物培养基微生物培养基(Culture medium)4.1.1 4.1.1 培养基成分培养基成分4.1.2 4.1.2 培养基的种类培养基的种类4.1.3 4.1.3 培养基的优化培养基的优化4.1.4 4.1.4 影响培养基质量的因素影响培养基质量的因素4.1.5 4.1.5 培养基灭菌技术培养基灭菌技术淀粉水解淀粉水解(hydrolase)(hydrolase)工艺工艺酸水解：酸水解：酸酸-酶法：酶法：双酶法：高温淀粉酶，糖化酶。双酶法：高温淀粉酶，糖化酶。双酶法制糖主要过程：玉米淀粉原料出双酶法制糖主要过程：玉米淀
2、粉原料出发，经配料，糊化，液化和糖化，脱色发，经配料，糊化，液化和糖化，脱色过滤，制备成淀粉水解糖。过滤，制备成淀粉水解糖。酶法酶法(Enzymatic)(Enzymatic)制糖制糖糊糊化化：淀淀粉粉乳乳加加热热，淀淀粉粉颗颗粒粒膨膨胀胀，晶晶体体结结构构消失，变成糊状液体，淀粉不再沉淀。消失，变成糊状液体，淀粉不再沉淀。液液化化：利利用用淀淀粉粉酶酶(amylase)(amylase)使使糊糊化化淀淀粉粉水水解解到到一一定定的的糊糊精精和和低低聚聚糖糖程程度度，粘粘度度大大大大降降低低，流动性增加。流动性增加。糖化：（糖化：（C C6 6H H1010O O5 5）n+nHn+nH2 2O
3、=nCO=nC6 6H H1212O O6 6 淀粉淀粉(glucoamylase)(glucoamylase)水水 162 18 180 162 18 180 1000 X=1000 X=DEDE值值:用用DEDE值值表表示示淀淀粉粉水水解解的的程程度度或或糖糖化化程程度度。糖糖化化液液中中还还原原性性糖糖以以葡葡萄萄糖糖计计，占占干干物物质质的的百百分分比比称称为为DEDE值。值。DEDE值计算：值计算：DE=DE=还原糖浓度（还原糖浓度（C C2 2）100%100%干物质浓度（干物质浓度（W W1 1）糖液比重（糖液比重（d d）还还原原糖糖用用裴裴林林氏氏法法等等法法测测定定，浓浓度
4、度表表示示：葡葡萄萄糖糖g/100mlg/100ml糖液；糖液；干物质用阿贝折光仪测定，浓度表示：干物质干物质用阿贝折光仪测定，浓度表示：干物质g/100gg/100g糖液。糖液。淀粉糖制备(酸化法）1.1.调粉。在调粉桶内先加部分水（可使用调粉。在调粉桶内先加部分水（可使用离交或滤机洗水），在搅拌情况下加入淀离交或滤机洗水），在搅拌情况下加入淀粉原料，投料完毕，继续加水使淀粉乳达粉原料，投料完毕，继续加水使淀粉乳达到规定浓度（到规定浓度（40%40%），然后加入盐酸调节至），然后加入盐酸调节至规定规定pHpH值。值。2.2.糖化。调好的淀粉乳，用耐酸泵送入糖糖化。调好的淀粉乳，用耐酸泵送入糖
5、化罐，进料完毕打开蒸气阀升压力至化罐，进料完毕打开蒸气阀升压力至2.8kg/cm2.8kg/cm2 2左右，保持该压力左右，保持该压力3 35min5min。取。取样，用样，用20%20%碘液检查糖化终点。糖化液遇碘碘液检查糖化终点。糖化液遇碘呈酱红色即可放料中和。呈酱红色即可放料中和。3 3 中和。糖化液转入中和桶进行中和，开始搅中和。糖化液转入中和桶进行中和，开始搅拌时加入定量废炭作助滤剂，逐步加入拌时加入定量废炭作助滤剂，逐步加入10%10%碳碳酸钠溶液中和，要掌握混和均匀，达到所需的酸钠溶液中和，要掌握混和均匀，达到所需的pHpH值后，打开出料阀，用泵将糖液送入过滤机。值后，打开出料阀
6、，用泵将糖液送入过滤机。滤出的清糖液随即送至冷却塔，冷却后糖液进滤出的清糖液随即送至冷却塔，冷却后糖液进行脱色。行脱色。4 4 脱色。清糖液放入脱色桶内，加入定量活脱色。清糖液放入脱色桶内，加入定量活性炭随加随拌，脱色搅拌时间不得少于性炭随加随拌，脱色搅拌时间不得少于5 5分钟分钟（指糖液放满桶后），然后再送至过滤机，滤（指糖液放满桶后），然后再送至过滤机，滤出清液盛放在贮桶内备用。出清液盛放在贮桶内备用。5 5 离子交换。将第一次脱色滤清液送至离子离子交换。将第一次脱色滤清液送至离子交换滤床进行脱盐、提纯及脱色。糖液通过阳交换滤床进行脱盐、提纯及脱色。糖液通过阳-阴阴-阳阳-阴阴4 4个树脂
7、滤床后，在贮糖桶内调整个树脂滤床后，在贮糖桶内调整pHpH值至值至3.83.84.24.2。6 6 第一次蒸发。离子交换后，准确调第一次蒸发。离子交换后，准确调好好pHpH值的糖液，利用泵送至蒸发罐，保值的糖液，利用泵送至蒸发罐，保持真空度在持真空度在500500毫米汞柱以上，加热蒸气毫米汞柱以上，加热蒸气压力不得超过压力不得超过1 1公斤公斤/厘米厘米2 2，控制蒸发，控制蒸发浓缩的中转化糖浆浓度在浓缩的中转化糖浆浓度在424250%50%左右。左右。可出料进行第二次脱色。可出料进行第二次脱色。7 7 二次脱色过滤。经第一次蒸发后的二次脱色过滤。经第一次蒸发后的中转化糖浆送至脱色桶，再加入定
8、量新中转化糖浆送至脱色桶，再加入定量新鲜活性炭，操作与第一次脱色相同。二鲜活性炭，操作与第一次脱色相同。二次脱色糖浆必须反复回流过滤至无活性次脱色糖浆必须反复回流过滤至无活性炭微粒为止，方可保证质量。然后将清炭微粒为止，方可保证质量。然后将清透、无色的中转化糖浆，送至贮糖桶。透、无色的中转化糖浆，送至贮糖桶。8 8 第二次蒸发。该道操作基本上与第第二次蒸发。该道操作基本上与第一次蒸发操作相同，只是第二次蒸发开一次蒸发操作相同，只是第二次蒸发开始后，加入适量亚硫酸氢钠溶液（始后，加入适量亚硫酸氢钠溶液（3535波波美度），能起到漂白而保护色泽的作用。美度），能起到漂白而保护色泽的作用。蒸发至规定
9、的浓度，即可放料至成品桶蒸发至规定的浓度，即可放料至成品桶内。内。上述的工艺操作规程，主要指特、甲级上述的工艺操作规程，主要指特、甲级成品而言，如生产乙级成品的操作工序，成品而言，如生产乙级成品的操作工序，只要求一次脱色和一次蒸发，而且有些只要求一次脱色和一次蒸发，而且有些操作指标也略有差异操作指标也略有差异 双酶法制糖工艺双酶法制糖工艺1 1 调浆配料槽；调浆配料槽；2 2，8 8过滤器；过滤器；3 3，9 9，1414，1717，泵；，泵；4 4，1010喷射加热器；喷射加热器；5 5缓冲缓冲器；器；6 6液化层流罐；液化层流罐；7 7液态液贮槽；液态液贮槽；1111灭菌罐；灭菌罐；121
10、2板式换热器；板式换热器；1313糖化罐；糖化罐；1515压滤机；压滤机；1616糖化液贮槽；糖化液贮槽；1818糖液贮槽糖液贮槽双酶法制备玉米粉水解糖液的双酶法制备玉米粉水解糖液的优化工艺优化工艺液化酶用量液化酶用量55l/100 g55l/100 g玉米粉玉米粉(1 100(1 100 U/100 gU/100 g玉米粉玉米粉)；液化时间液化时间89 min89 min；糖化酶的量糖化酶的量400;l/100 g400;l/100 g玉米粉玉米粉(20(20 000 U/100 g000 U/100 g玉米粉玉米粉)；糖化时间糖化时间284 min284 min；淀粉转化率可达到淀粉转化率
11、可达到93.95%.93.95%.氮氮源源(Nitrogen source)(Nitrogen source)氮源的主要功能：氮源的主要功能：构成微生物细胞物质构成微生物细胞物质含氮代谢物的原料；含氮代谢物的原料；发发酵酵液液pHpH调调节节：在在发发酵酵罐罐中中通通入入氨氨可可起起到到双双重重作用。作用。有机氮源有机氮源(organic nitrogen sources)(organic nitrogen sources)有有机机氮氮源源除除含含有有丰丰富富的的蛋蛋白白质质、多多肽肽和和游游离离氨氨基基酸酸外外，往往往往还还含含有有少少量量的的糖糖类类、脂脂肪肪、无无机机盐盐、维维生生素素及
12、及其其某某些些生生长长因因子子。因因而而微微生生物物在在含含有有机机氮氮源源的的培培养养基基中中常常表表现现出出生生长长旺旺盛盛、菌菌体浓度增长迅速的特点，体浓度增长迅速的特点，微生物在有机氮源培养基中，可直接利用氨基微生物在有机氮源培养基中，可直接利用氨基酸和其它有机氮化合物中的各种不同结构的碳酸和其它有机氮化合物中的各种不同结构的碳架，来合成生命所需要的蛋白质和其它细胞物架，来合成生命所需要的蛋白质和其它细胞物质，而无需从糖代谢的分解产物来合成所需的质，而无需从糖代谢的分解产物来合成所需的物质。物质。微生物对氨基酸利用的选择性微生物对氨基酸利用的选择性氮源直接作为药物的前提物。氮源直接作为
13、药物的前提物。某些氨基酸作为合成肽类抗生素的前体物质。某些氨基酸作为合成肽类抗生素的前体物质。螺旋霉素发酵中，发酵培养基里加入螺旋霉素发酵中，发酵培养基里加入L-L-色氨酸色氨酸可使螺旋霉素的产量显著提高，但加入可使螺旋霉素的产量显著提高，但加入L-L-赖氨赖氨酸会完全抑制螺旋霉素的生物合成。酸会完全抑制螺旋霉素的生物合成。缬缬氨氨酸酸、半半胱胱氨氨酸酸和和氨氨基基己己二二酸酸等等就就是是合合成青霉素和头孢菌素的主要前体；成青霉素和头孢菌素的主要前体；蛋白胨（Peptone）最常用的氮源，营养价值高。最常用的氮源，营养价值高。用于蛋白胨生产的蛋白包括动物蛋白（酪蛋白、用于蛋白胨生产的蛋白包括动
14、物蛋白（酪蛋白、肉类）和植物蛋白（豆类）两种。肉类）和植物蛋白（豆类）两种。蛋白质经水解降解生成的多肽，二肽及复合氨蛋白质经水解降解生成的多肽，二肽及复合氨基酸物。具有蛋白质的通性。基酸物。具有蛋白质的通性。1.1.色泽：白色粉末或浅黄色粉末色泽：白色粉末或浅黄色粉末 2.2.总氮量：总氮量：14.5%14.5%以上以上 3.3.水份水份5%4.5%4.灰份：灰份：5%5%以下以下 5.5.总总磷量磷量0.2%6.0.2%6.氯化物氯化物5%7.pH5%7.pH值：值：5-75-7。牛肉膏(Beef Extract)采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、
15、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。牛肉膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基牛肉膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。该产品广泛应用于生物制素类的水溶性物质。该产品广泛应用于生物制药发酵及各种培养基的制备。药发酵及各种培养基的制备。酵母浸提物酵母粉酵母粉(Yeast Extract powder)(Yeast Extract powder)酵母浸粉酵母浸粉 采用新鲜酵母经酵母
16、自溶、过滤、浓缩、喷雾干燥而得到的采用新鲜酵母经酵母自溶、过滤、浓缩、喷雾干燥而得到的一种浅黄色至类白色干燥粉末。有酵母自然香味，易溶于水，一种浅黄色至类白色干燥粉末。有酵母自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。极具吸湿性，水溶液呈淡黄色。极具吸湿性，酵母粉含有氨基酸类、肽类、水溶性维生素、及酵母多糖、酵母粉含有氨基酸类、肽类、水溶性维生素、及酵母多糖、酵母核酸组成的一种混合物，含有丰富的酵母核酸组成的一种混合物，含有丰富的B B族维生素和各种氨族维生素和各种氨基酸。核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性基酸。核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。一般的用量为物质。一般的用
17、量为0.2%0.2%0.5%0.5%。酵母膏酵母膏(Yeast Extract)(Yeast Extract)酵母浸膏酵母浸膏 采用新鲜酵母经酵母自溶、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色采用新鲜酵母经酵母自溶、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有酵母自然香味，易溶于水，水溶液呈至棕褐色的膏状物。有酵母自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色至浅棕色。含氨基酸类、肽类、水溶性维生素、及酵淡黄色至浅棕色。含氨基酸类、肽类、水溶性维生素、及酵母多糖、酵母核酸组成的一种混合物，含有丰富的母多糖、酵母核酸组成的一种混合物，含有丰富的B B族维生素族维生素和各种氨基酸。核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素
18、类和各种氨基酸。核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。一般的用量为的水溶性物质。一般的用量为0.2%0.2%0.5%0.5%。黄豆粉（黄豆粉（soybean meal)soybean meal)黄豆粉是发酵生产中常用的有机氮源。黄豆粉是发酵生产中常用的有机氮源。根据油脂含量可将其分为三类：根据油脂含量可将其分为三类：全全脂脂黄黄豆豆粉粉(含含油油脂脂18%)18%)，低低脂脂黄黄豆豆粉粉(含含油油脂脂9%)9%)，脱脂黄豆粉，脱脂黄豆粉(含油脂含油脂2%)2%)。低低温温提提取取油油脂脂后后加加工工制制备备；高高温温提提取取油油脂脂后后加加工制备。工制备。酶解大豆水解液的应用及优
19、点。酶解大豆水解液的应用及优点。棉籽饼粕，花生粕也是应用较广泛的有机氮源。棉籽饼粕，花生粕也是应用较广泛的有机氮源。玉米浆玉米浆(Corn Steep Liquor(Corn Steep Liquor，简称，简称CSL)CSL)玉玉米米浆浆是是用用亚亚硫硫酸酸浸浸泡泡玉玉米米的的水水经经过过浓浓缩缩加加工工制制成成的的，呈呈鲜鲜黄黄到到暗暗褐褐色色、浓浓稠稠不不透透明的絮状悬浮物，约含明的絮状悬浮物，约含50%50%干物质；干物质；玉玉米米浆浆中中含含有有较较丰丰富富的的玉玉米米可可溶溶性性蛋蛋白白，很容易被微生物利用。富含维生素。很容易被微生物利用。富含维生素。由由于于玉玉米米的的来来源源，
20、不不同同加加工工条条件件各各异异，因因此此，玉玉米米浆浆的的成成分分常常有有较较大大波波动动，在在使使用用时应注意适当调配。时应注意适当调配。玉米浆粉的应用。玉米浆粉的应用。无机氮源无机氮源(inorganic N source)(inorganic N source)多多种种放放线线菌菌、霉霉菌菌或或细细菌菌都都能能利利用用各各种种无无机机氮源为主要或辅助氮源，氮源为主要或辅助氮源，常用的有硫酸铵、硝酸铵等。常用的有硫酸铵、硝酸铵等。铵铵盐盐中中的的铵铵氮氮可可以以直直接接被被菌菌体体利利用用来来合合成成细细胞胞中中的的含含氮氮物物质质，硝硝基基氮氮必必须须先先还还原原成成氨氨后后，才才能被
21、利用，所以铵盐的利用比硝基快。能被利用，所以铵盐的利用比硝基快。无机氮源的生理酸或生理碱物质无机氮源的生理酸或生理碱物质生理酸性物质：如硫酸铵生理酸性物质：如硫酸铵（NHNH4 4）2SO2SO4 4 2NH 2NH3 3+H+H2 2SOSO4 4生理碱性物质，如硝酸盐生理碱性物质，如硝酸盐NaNONaNO3 3+4H+4H2 2 NH NH3 3+2H+2H2 2O+NaOHO+NaOH无机盐及微量元素无机盐及微量元素磷酸盐磷酸盐:核蛋白等重要细胞物质的组成部分，核蛋白等重要细胞物质的组成部分，许多辐酶许多辐酶(或辐基或辐基)、高能磷酸键的组成部分、高能磷酸键的组成部分磷在菌体生长、繁殖和
22、代谢活动中起着极其重磷在菌体生长、繁殖和代谢活动中起着极其重要的作用，磷还可以防止青霉素的破坏，要的作用，磷还可以防止青霉素的破坏，过量的磷酸盐对某些抗生素合成产生抑制作用。过量的磷酸盐对某些抗生素合成产生抑制作用。培养基中钙盐过多时，会形成磷酸钙沉淀，降培养基中钙盐过多时，会形成磷酸钙沉淀，降低培养基中可溶性磷的含量，低培养基中可溶性磷的含量，当培养基中磷和钙均要求较高浓度时，可将两当培养基中磷和钙均要求较高浓度时，可将两者分别消毒或逐步补加。者分别消毒或逐步补加。硫和铁硫和铁硫也是菌体细胞蛋白质的组成部分。它参与合硫也是菌体细胞蛋白质的组成部分。它参与合成含硫氨基酸的元素，也是某些抗生素分
23、子中成含硫氨基酸的元素，也是某些抗生素分子中的组成元素。含硫的氨基酸，如甲硫氨酸是甲的组成元素。含硫的氨基酸，如甲硫氨酸是甲基供体。基供体。铁是菌体细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化铁是菌体细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化物酶的组成元素，是菌体生命活动必须的元素物酶的组成元素，是菌体生命活动必须的元素之一。之一。微量金属无素微量金属无素锌锌、镁镁、钴钴等等离离子子是是某某些些酶酶的的辅辅基基或或激激活活剂剂。微微量量的的锌锌对对青青霉霉素素发发酵酵有有促促进进作作用用，但但过过量量时时对青霉素有破坏作用。对青霉素有破坏作用。镁镁离离子子除除了了有有激激活活一一些些酶酶的的作作用用外外，还还可可提
24、提高高抗生素生产菌对自己所产抗生素的耐性。抗生素生产菌对自己所产抗生素的耐性。钴钴离离子子也也能能激激活活一一些些酶酶，又又是是维维生生素素B B1212的的组组成成元元素素，发发酵酵中中加加入入一一定定量量的的钴钴盐盐，能能使使维维生生素素B B1212的产量提高数倍。的产量提高数倍。前体物前体物(precursors)(precursors)前体物以整体结构加入到新合成的物质中。前体物以整体结构加入到新合成的物质中。在培养基中加入前体物可大大提高产物的浓度。在培养基中加入前体物可大大提高产物的浓度。如何寻找到合适的前体物是培养基配方研究的如何寻找到合适的前体物是培养基配方研究的重点。重点。
25、青霉素的前体物质是苯乙酸及有关衍生物；青霉素的前体物质是苯乙酸及有关衍生物；金霉素的前体物质是氯化物；金霉素的前体物质是氯化物；维生素维生素B B1212的前体物是钴化物；的前体物是钴化物；胡萝卜素的前体物是胡萝卜素的前体物是-紫罗兰酮，等等紫罗兰酮，等等 促进剂促进剂是指哪些既不是营养物又不是前体，但促进剂是指哪些既不是营养物又不是前体，但能提高产物产量的添加剂。能提高产物产量的添加剂。加入巴比妥盐能使利福霉素单位增加，并能使加入巴比妥盐能使利福霉素单位增加，并能使链霉菌推迟自溶，延长分泌期链霉菌推迟自溶，延长分泌期 抑制剂（抑制剂（inhibitor)inhibitor)加加入入抑抑制制剂
26、剂会会抑抑制制某某些些代代谢谢途途径径的的进进行行，同同时时会会使使另另一一代代谢谢途途径径活活跃跃，从从而而获获得得人人们们所所需需要要的的某某种种产产物物或或使使正正常常代代谢谢的的某某一一代代谢谢中中间间物物积积累起来。累起来。四四环环素素发发酵酵中中，加加入入溴溴化化剂剂(NaBr)(NaBr)能能抑抑制制金金霉霉素形成的代谢途径，促进四环素的生成。素形成的代谢途径，促进四环素的生成。水在液态发酵培养基中，水的比例最大。在液态发酵培养基中，水的比例最大。水源：自来水，深井水，河水，不同地水源：自来水，深井水，河水，不同地区的水源；区的水源；水质：主要是水中的杂质，尤其是微量水质：主要是
27、水中的杂质，尤其是微量元素的含量。元素的含量。自来水管中的铁锈往往在不同时间含量自来水管中的铁锈往往在不同时间含量不同。一般在早班时含量最高。不同。一般在早班时含量最高。增加细胞通透性的物质表面活性剂：吐温-80；曲拉通Toluene TritonX-100Span-20 但需注意是否残留在产品中，是否符合药品安全4.1.2培养基的种类培养基的种类培养基的种类与选择培养基的种类与选择培养基的类型：培养基的类型：按按培培养养基基组组成成物物质质的的纯纯度度，分分为为合合成成培培养养基基和天然培养基和天然培养基(复合培养基复合培养基)。按按培培养养基基的的状状态态，培培养养基基可可分分为为固固体体
28、培培养养基基、半固体培养基和液体培养基。半固体培养基和液体培养基。依依据据在在生生产产中中的的用用途途(或或作作用用)，可可将将生生产产上上应应用用培培养养基基分分为为孢孢子子培培养养基基、种种子子培培养养基基和和生生产产培养基。培养基。(1)孢子孢子(spore)(spore)培养基培养基孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这种培养基的要求是能够使菌体迅速生长，基，对这种培养基的要求是能够使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，并要求这种培养基不易引起产生较多优质的孢子，并要求这种培养基不易引起菌种发生变异。菌种发生变异。孢子培养基的基本
29、配制要求：孢子培养基的基本配制要求：营养不要太丰富营养不要太丰富(有机氮源有机氮源)，否则不易产生孢子；，否则不易产生孢子；如土豆葡萄糖培养基如土豆葡萄糖培养基(PD).(PD).所用无机盐的浓度要适量，否则会影响孢子量和孢所用无机盐的浓度要适量，否则会影响孢子量和孢子颜色；子颜色；要注意孢子培养基的要注意孢子培养基的pHpH和湿度。生产中常用的孢子和湿度。生产中常用的孢子培养基有麸皮培养基，大培养基有麸皮培养基，大(小小)米培养基，由葡萄糖米培养基，由葡萄糖(或淀粉或淀粉)、无机盐、蛋白胨等配制的琼脂斜面培养、无机盐、蛋白胨等配制的琼脂斜面培养基基 (2)(2)种子种子(seed)(seed
30、)培养基培养基种种子子培培养养基基是是供供孢孢子子发发芽芽和和菌菌种种生生长长繁繁殖殖用用的的。营营养养成成分分应应是是易易被被菌菌体体吸吸收收利利用用的的，同同时时要要比比较较丰丰富富与与完完全全，其其中中氮氮源源和和维维生生素素的的含含量量要要高高些些，但总浓度以略稀薄为宜以便菌体的生长繁殖。但总浓度以略稀薄为宜以便菌体的生长繁殖。种种子子培培养养基基的的营营养养成成分分是是易易于于吸吸收收的的碳碳源源和和氮氮源源，如如葡葡萄萄糖糖、硫硫酸酸铵铵、尿尿素素、玉玉米米浆浆、酵酵母母膏膏和和蛋蛋白胨等。白胨等。种种子子质质量量的的好好坏坏对对发发酵酵的的影影响响很很大大，为为了了使使培培养养的
31、的种种子子能能够够满满足足发发酵酵的的要要求求，必必须须将将种种子子培培养养基基和发酵的要求联系起来考虑。和发酵的要求联系起来考虑。最最后后一一级级种种子子培培养养基基的的成成分分应应接接近近发发酵酵培培养养基基，可可使使种种子子进进入入发发酵酵培培养养基基后后能能迅迅速速适适应应，快快速速生生长。长。(3)发酵培养基发酵培养基发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接种后迅速生长，达到一定用。它既要使种子接种后迅速生长，达到一定的菌体浓度，又要使长好的菌体能迅速合成所的菌体浓度，又要使长好的菌体能迅速合成所需产物。需产物。发酵培养基的组
32、成除有菌体生长所必需的元素发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。但如果生长和生物合成产物需体和促进剂等。但如果生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最适条件不同时，还生长和合成两阶段各需的最适条件不同时，还应考虑补加培养基来满足发酵工艺的要求应考虑补加培养基来满足发酵工艺的要求 4.1.3培养基的优化培养基的优化培养基设计的原理：培养基设计的原理：根据微生物的性质选取营养物质的种类；根据微生物的性质选取营养物质的种类
33、；培培养养基基的的组组分分（来来源源和和加加工工方方法法）；配配比比；缓缓冲冲能能力力，粘粘度度，消消毒毒是是否否彻彻底底，是是否否破破坏坏？原原料中是否有不良杂质。料中是否有不良杂质。注注意意快快速速利利用用的的碳碳(氮氮)源源和和慢慢速速利利用用的的碳碳(氮氮)源的相互配合源的相互配合,发挥各自的优势发挥各自的优势,避其所短。避其所短。要要注注意意生生理理酸酸、碱碱性性盐盐和和pHpH缓缓冲冲剂剂的的加加入入和和搭搭配。配。碳氮比碳氮比选选用用适适当当的的碳碳氮氮比比。培培养养基基中中的的碳碳氮氮比比的的影影响响十十分分明明显显。氮氮源源过过多多，会会使使菌菌体体生生长长过过于于旺旺盛盛，
34、pHpH偏偏高高，不不利利于于代代谢谢产产物物的的积积累累；氮氮源源不不足足，则则菌菌体体繁繁殖殖量量少少，从从而而影影响响产产量量。碳碳源源过过多多，则则容容易易形形成成较较低低的的pHpH，若若氮氮源源不不足足，易易引引起起菌菌体体衰衰老和自溶。老和自溶。从从碳碳氮氮元元素素分分析析来来看看，酵酵母母菌菌细细胞胞中中碳碳氮氮比比约约为为100:20100:20；霉霉菌菌约约为为100:10100:10；一一般般 工工 业业 发发 酵酵 培培 养养 基基 的的 碳碳 氮氮 比比 约约 为为100:0.2-2.0100:0.2-2.0（思考：为何低得多）。（思考：为何低得多）。碳氮比如何计算？
35、含碳化合物与含氮化合物：含碳化合物与含氮化合物：C/N C/N比。重量比。重量比比,摩尔比。摩尔比。含碳原料中含碳原料中C C含量的计算：含量的计算：含含N N原料，氨基酸中的原料，氨基酸中的N N计算：计算：蛋白质的原料（豆饼粉等）中蛋白质的原料（豆饼粉等）中N N的计算：要的计算：要根据粗蛋白质的含量，折算成根据粗蛋白质的含量，折算成N N含量。含量。含含N N原料中，如有原料中，如有C C的含量，也应计入的含量，也应计入C C源总源总量。量。培养基优化实验方法培养基优化实验方法一般采用摇瓶，小型发酵罐实验；一般采用摇瓶，小型发酵罐实验；先进行单因素实验，最后再进行综合实先进行单因素实验，
36、最后再进行综合实验。验。在选择培养基中使用的最适原材料种类在选择培养基中使用的最适原材料种类和浓度配比时，经常采用的方法有单因和浓度配比时，经常采用的方法有单因子实验法、正交试验设计和均匀试验设子实验法、正交试验设计和均匀试验设计等。计等。采用正交试验设计或均匀试验设计等方采用正交试验设计或均匀试验设计等方法，可大大加快试验进程。法，可大大加快试验进程。4.1.4 影响培养基质量的因素影响培养基质量的因素原材料质量的影响原材料质量的影响 水质的影响水质的影响 灭菌操作的影响灭菌操作的影响糖类在高温条件下易被破坏，特别是还原糖与糖类在高温条件下易被破坏，特别是还原糖与氨基酸、肽类或蛋白质等有机氮
37、源一起加热时，氨基酸、肽类或蛋白质等有机氮源一起加热时，更容易产生化学反应，形成更容易产生化学反应，形成5-5-甲基糠醛和鬃色甲基糠醛和鬃色的类黑精。为避免糖类与其它成分在灭菌过程的类黑精。为避免糖类与其它成分在灭菌过程中相互接触，在生产中有时将糖和其它成分分中相互接触，在生产中有时将糖和其它成分分别灭菌，别灭菌，其他因素的影响其他因素的影响 培培养养基基的的pH:pH:pHpH对对菌菌体体的的生生物物代代谢谢有有较较大大的的影影响响。在在工工业业上上，通通过过改改变变培培养养基基成成分分的的配配比比，使使在在发发酵酵过过程程中中的的pHpH变变化化适适合合菌菌种种代代谢谢的的要要求求，或或者
38、者直直接接加加酸酸或或碱调节。碱调节。培培养养基基粘粘度度：特特别别是是用用如如淀淀粉粉、黄黄豆豆饼饼粉粉、花花生生饼饼粉粉等等，所所配配制制的的培培养养基基比比较较稠稠厚厚，对对空空气气的的利利用用、染染菌菌率率的的控控制制以以及及各各项项参参数数的的自自控控都都不不利利，对对提提取取精精制也有影响。制也有影响。4.2 菌种扩大培养菌种扩大培养种子的概念种子的概念3.4.1 3.4.1 实验室种子培养实验室种子培养3.4.2 3.4.2 生产车间种子培养生产车间种子培养3.4.3 3.4.3 接种龄与接种量接种龄与接种量3.4.4 3.4.4 影响种子质量的因素影响种子质量的因素3.4.5
39、3.4.5 种子质量的控制措施种子质量的控制措施保存菌种的种类保存菌种的种类菌种的保存方式：斜面菌；砂土管，低菌种的保存方式：斜面菌；砂土管，低温保存，冷冻干燥管，液氮保存；温保存，冷冻干燥管，液氮保存；孢子悬浮液，液体种子，固体种；孢子悬浮液，液体种子，固体种；菌种的活化：尤其是冷藏法保存的菌种菌种的活化：尤其是冷藏法保存的菌种需先培养一定时间再移接若干代。需先培养一定时间再移接若干代。菌种低温保藏设备菌种低温保藏设备超低温冰箱（超低温冰箱（-85-85）和液氮瓶（）和液氮瓶（-195-195）：）：一般植物或微生物种子保存用超低温冰箱较一般植物或微生物种子保存用超低温冰箱较多。多。-85-
40、85冰箱，要选择质量好的，尤其是冰箱冰箱，要选择质量好的，尤其是冰箱压缩机的性能是最主要的指标。压缩机的性能是最主要的指标。冰箱所在地的电源应有保证。以防断电时间冰箱所在地的电源应有保证。以防断电时间过长时引起菌种的衰退。电压稳定（故需要过长时引起菌种的衰退。电压稳定（故需要配稳压电源）。配稳压电源）。冷冻菌种的复活冷冻菌种的复活将冷冻或液氮保藏的菌种取出，迅速放入将冷冻或液氮保藏的菌种取出，迅速放入3737水浴中解冻。一般需水浴中解冻。一般需22.5min22.5min，等完全解冻后，等完全解冻后，用无菌吸管，在安瓿管内注入用无菌吸管，在安瓿管内注入0.3-0.5ml0.3-0.5ml的无的
41、无菌生理盐水或菌生理盐水或1%1%麦芽汁等适宜的液体培养基，麦芽汁等适宜的液体培养基，轻轻振荡，使冻于菌体溶解呈悬浮状。取轻轻振荡，使冻于菌体溶解呈悬浮状。取0.10.10.2ml0.2ml菌体悬浮液，移植于适宜的琼脂斜面菌体悬浮液，移植于适宜的琼脂斜面平板培养基上，剩余的菌液，注入适宜的液平板培养基上，剩余的菌液，注入适宜的液体培养基内，然后在建议的温度下培养。体培养基内，然后在建议的温度下培养。菌种扩大培养过程保存菌种（斜面种，沙土管，冻干管）保存菌种（斜面种，沙土管，冻干管）斜面种子（活化，培养）斜面种子（活化，培养）摇瓶，茄子瓶斜面，固体培养基摇瓶，茄子瓶斜面，固体培养基 种子罐（一级
42、，二级，三级或四级）种子罐（一级，二级，三级或四级）4.2.1 实验室种子培养实验室种子培养对于细菌类种子，一般采用从斜面移接对于细菌类种子，一般采用从斜面移接到三角摇瓶；到三角摇瓶；对于产孢子的菌种，可采用砂土管孢子，对于产孢子的菌种，可采用砂土管孢子，或冷冻管孢子等，接入固态培养基上，或冷冻管孢子等，接入固态培养基上，培养大量孢子；培养大量孢子；对于不产孢子的放线菌或霉菌，也可在对于不产孢子的放线菌或霉菌，也可在茄子瓶中大量培养菌丝体，或摇瓶培养。茄子瓶中大量培养菌丝体，或摇瓶培养。孢子浓度与孢子浓度与OD值的关系：值的关系：由于测定由于测定ODOD值比孢子数的测定更为简单，而值比孢子数的
43、测定更为简单，而孢子数与孢子数与ODOD值存在一定的线性关系，故经过值存在一定的线性关系，故经过实验，可确定两者之间的关系。计算公式实验，可确定两者之间的关系。计算公式Y Y=80.79045=80.79045X X+3.61871 +3.61871 （3-273-27）式中式中Y Y孢子浓度，个孢子浓度，个/mL/mL；X XODOD750750。4.2.2 生产车间种子培养生产车间种子培养实验室培养的菌悬液或菌丝体种子接入种子罐，实验室培养的菌悬液或菌丝体种子接入种子罐，一般采用压差法。孢子悬浮液一般采用微滤法。一般采用压差法。孢子悬浮液一般采用微滤法。注意罐压应高于气压。注意罐压应高于气
44、压。逐级扩大的种子罐；逐级扩大的种子罐；种子罐级数的确定：依据菌种特性，孢子发芽种子罐级数的确定：依据菌种特性，孢子发芽数量，菌种繁殖速度，发酵罐容积等。数量，菌种繁殖速度，发酵罐容积等。一般细菌类，可采用一级种子；生长慢的菌种，一般细菌类，可采用一级种子；生长慢的菌种，采用二级种子（发芽罐和繁殖罐二级）；采用二级种子（发芽罐和繁殖罐二级）；浅盘式种曲培养机该种曲机分为两部分：培养室和附属装置。培养室该种曲机分为两部分：培养室和附属装置。培养室是一个卧式的夹套式压力容器。培养室内有小车，是一个卧式的夹套式压力容器。培养室内有小车，车内放置车内放置10201020个培养盘。曲料放在培养盘内。培个
45、培养盘。曲料放在培养盘内。培养室内还设有循环室内空气用的风扇、种曲流向分养室内还设有循环室内空气用的风扇、种曲流向分配盘和加湿雾化器等。配盘和加湿雾化器等。附属装置包括种曲供给装置（二级种曲贮罐、无菌附属装置包括种曲供给装置（二级种曲贮罐、无菌压缩空气供给装置）、空气供给装置（空压机、压压缩空气供给装置）、空气供给装置（空压机、压缩空气贮罐、过滤器和灭菌装置）、真空吸引装置缩空气贮罐、过滤器和灭菌装置）、真空吸引装置（水力喷射器，用于培养室内物料降温）、温度调（水力喷射器，用于培养室内物料降温）、温度调节装置（控温台、温冷水调温装置和加湿装置）。节装置（控温台、温冷水调温装置和加湿装置）。种曲
46、培养机4.2.3 接种龄与接种量接种龄与接种量接种龄：以菌种处于旺盛的对数生长期，且菌接种龄：以菌种处于旺盛的对数生长期，且菌体量未达到最高峰时为宜；体量未达到最高峰时为宜；过于年轻的种子，造成前期生长慢，发酵周期过于年轻的种子，造成前期生长慢，发酵周期长的后果；年老的种子，生产能力下降，菌丝长的后果；年老的种子，生产能力下降，菌丝过早衰老。过早衰老。接种量：种子液体积与接种后培养液体积之比。接种量：种子液体积与接种后培养液体积之比。决定于菌种的繁殖速度。接种量一般为决定于菌种的繁殖速度。接种量一般为5-15%5-15%。接种量多：缩短时间，产物提前合成；但太多，接种量多：缩短时间，产物提前合
47、成；但太多，则影响产物合成。易形成菌丝球。则影响产物合成。易形成菌丝球。4.2.4 影响种子质量的因素影响种子质量的因素原材料的质量；原材料的产地，同一产原材料的质量；原材料的产地，同一产地不同批次质量的波动；地不同批次质量的波动；培养条件：培养条件：pHpH，温度，湿度，通气等。，温度，湿度，通气等。斜面的冷藏时间。斜面的冷藏时间。如何判断种子的质量：如何判断种子的质量：pHpH，培养基中磷，培养基中磷，氮，氨基酸含量，菌丝形态，浓度，培氮，氨基酸含量，菌丝形态，浓度，培养液外观，酶活。养液外观，酶活。4.2.5 种子质量的控制措施种子质量的控制措施菌种培养人员的素质和责任心；菌种培养人员的
48、素质和责任心；菌种观察及选择（菌丝形态整齐，孢子菌种观察及选择（菌丝形态整齐，孢子丰满）。丰满）。菌种稳定性定期检查的必要性；经常性菌种稳定性定期检查的必要性；经常性的摇瓶实验确定其生产性能。的摇瓶实验确定其生产性能。无菌检查。无菌检查。4.3 培养基灭菌培养基灭菌4.3.1 4.3.1 概述概述4.3.2 4.3.2 培养基和设备灭菌培养基和设备灭菌4.3.3 4.3.3 空气除菌空气除菌4.3.1 4.3.1 概述概述4.3.1.1 4.3.1.1 灭菌操作的重要性灭菌操作的重要性灭菌是指用化学的或物理学的方法杀灭灭菌是指用化学的或物理学的方法杀灭或除掉物料或设备中所有有生命的有机或除掉物
49、料或设备中所有有生命的有机体的技术或工艺过程。体的技术或工艺过程。工业发酵法药物生成多为需氧的纯种发工业发酵法药物生成多为需氧的纯种发酵过程，因此与生产相关的原材料、设酵过程，因此与生产相关的原材料、设备等均需彻底除菌，这是防止发酵过程备等均需彻底除菌，这是防止发酵过程染菌、确保正常生产的关键。染菌、确保正常生产的关键。4.3.1.2 灭菌方法灭菌方法火焰灭菌火焰灭菌:接种针接种针,玻璃棒玻璃棒,三角瓶口三角瓶口.干干热热灭灭菌菌:160:160度度,1,1小小时时.用用于于灭灭菌菌后后需需保保持持干干燥的物品燥的物品.电热法或红外线电热法或红外线.湿热灭菌湿热灭菌:培养基等培养基等.射线灭菌
50、射线灭菌:紫外紫外(工作场所工作场所),),射线射线(干料干料).).化学试剂灭菌化学试剂灭菌:工作场所工作场所.高压静电灭菌高压静电灭菌:空气空气.介质过滤除菌介质过滤除菌:空气空气.化学试剂灭菌化学试剂灭菌0.1-0.25%高锰酸钾高锰酸钾:皮肤灭菌皮肤灭菌;2-5%漂白粉漂白粉:用具和车间环境消毒用具和车间环境消毒;75%酒精酒精:皮肤和玻璃器皿表面皮肤和玻璃器皿表面;0.25%新洁尔灭溶液新洁尔灭溶液:皮肤和玻璃器皿表面皮肤和玻璃器皿表面;环环境消毒境消毒.0.5%甲醛甲醛:6-12小时可杀灭所有芽孢细菌小时可杀灭所有芽孢细菌,可用可用于无菌室于无菌室,摇瓶间摇瓶间,空罐空罐,车间和熏