高级植物生理学实验报告.docx

《高级植物生理学实验报告.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高级植物生理学实验报告.docx（34页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。

1、高级植物生理学实跪报告学生：成勤勤导师：王忠教授2004年5月实验目录第一部分 氧电极的测氧技术及其应用3.科技摄影颖花开放的扫描摄影图（每隔两分钟拍一次）光诱导的紫鸭跖草气孔开闭的过程（每隔五分钟拍一次，第三十分钟时断光）大麦果皮细胞壁的荧光观察水稻茎的数码摄影图水稻茎的数码摄影图鸭舌草荧光摄影图a.韧皮部b.气隙c.纹孔导管 a.保卫细胞b.副卫细胞d.维管束鞘e.薄壁细胞c.气孔d.细胞壁大麦胚乳细胞（左）和对应细胞壁的荧光（右）细胞壁的荧光为双线，说明次生壁中具有高含量的纤维素紫鸭跖草气孔的荧光观察（一） 紫鸭跖草气孔的荧光观察（二）实验五、数码显微图像显示装置在显微摄影中的应用一、实

2、验原理FR970数码显微图像显示装置能安装在各种三目显微镜上进行显微摄影。 只要放好标本，调好显微镜，观察显示屏，轻按按钮，便可轻而易举地得到一张 高质量的显微彩色照片，这可节省冲洗胶卷和放大照片许多时间。该装置能利用储存卡作为图像储存媒体，可以随时将图像输入电脑作多种用 途，如图像处理、电子邮件或远程会诊等。本装置有4英寸TFT彩色显示屏，可 在彩色显示屏上直接浏览和观察显微镜视野里的图像，也可将储存卡里的显微图 像资料在显示屏上浏览和观察。该装置备有2、4及16格图像打印模式，可根据需要在一张照片上打印出相 同或不同的多幅画面。另外本装置可以在显微照片上方便地打印出拍摄日期，以备存档。还可

3、从视 频输出口上直接连接投影仪、大屏幕彩电等设备，对所拍摄的图像进行投影放大， 十分适用于电化教学。二、实验器材显微镜、DC750数码图像显示装置、植物切片、植物材料本实验采用的DCT50数码图像显示装置如图三、实验步骤1、仪器的连接（1）将数码图像显示装置的电源变压器一端（DC12V,红为正极，黑为负极）连 接在装置背后的电源插座上，另一端（AC220V）插入电源插座；（2）将数码图像显示装置与显微镜的接口连接上；（3）用视频连接线将数码图像显示装置背面的VIDEO （视频输出）连接至专用 打印机VIDEO INPUT （视频输入）接口，EXT （视频输入）连接至VIDEO OUTPUT（视

4、频输出）接口；即：Video- 打印机 Video InputEXTT 打印机 Video Output2、接通电源（1）打开显微镜开关和电源灯；（2）打开打印机开关，将打印机上Input Select （输入选择）开关选择至Still（静止图像）或Mot ion （运动图像）上，Preset Pr int （预设打印）和Date （日 期）放在OFF上。3、将样品放在显微镜载物台上，调整放大镜倍数，使之处于最佳状态。4、观察显示屏上的图像，调整显微镜焦距及亮度，使之达到最清晰。5、直接打印显示屏上显示的图像（1）根据需要将画面分割键盘（打印方式显示盘）设定好；（2）待图像确定后，按Captu

5、re （捕获）按钮，此时Memory （存储）指示灯闪 烁，若要退出此画面，按Picture （图像）按钮；（3）待闪烁停止后，将打印纸按要求插入，按Print （打印）按钮，打印指示 灯闪烁，打印纸自动进入，打印机开始打印，100秒左右打印完成。打印时，显 示屏右下方会依次出现黄、红、绿三种，绿色显示后打印完成。四、实验结果（如图）水稻根的显微摄影图a.残留的皮层薄壁细胞b.内皮层c.韧皮部d.导管e.机械组织f.气腔数码显微图像显示装置拍摄的水稻颖花开放图（数码相机每隔五分钟拍摄一次）实验六、植物材料的树脂切片及植物材料的电镜观察一、实验目的和意义观察细胞最常用的方法是先制作切片，然后用显

6、微镜观察。以下是用低粘性 spurr树脂包埋植物材料，用半/超薄切片机切片的方法。二、仪器与试剂1、仪器电子天平、振荡机、70 恒温箱、 玻璃制刀 机、半/超薄切片机、显微镜、 包埋模、制刀用的玻璃条、制 刀用的胶带和石蜡、镶子、刀 片、管瓶、滴瓶、切样用的塑 料板等。2 .试剂(1)缓冲溶液：0. 05mo I /L CaCo (sod i um cacody I ate 二甲基硅酸钠)pH7. 2 (2)固定剂：前固定剂：2%-3% GAL (glutaraldehyde 戊二醛) 1%(paraformaIdehyde 多聚甲醛)0. 05mol/L CoCo pH7. 2;后固定液：0

7、. 5%1%0s04(3)脱水剂：20%. 40%、60%, 80%、90%、95%、100%的乙醇；环氧丙烷(4)树脂：Spurr树脂(5)染色剂：0.5%1% TBO(toluidine blue-0 甲苯胺篮-0)三、Spurr树脂的配制Spur r树脂是由四种试剂按比例配制而成(表1)注：本实脸选用配方2表1 Spurr树脂常用配方试剂酉己方1 (邢i为更)配方2 (适中)配方3 (稍软)1.主剂：ERL-420610.0g10.0g10.0g2.可塑剂：DER-7365.5g6.0g6.5g3.硬化剂：NSA26. 0g26. 0g26. 0g4.催化剂：S-10.4g0.4g0.4

8、g配制时，盛树脂的烧杯放在电子天平上，按表中试剂的序顺，边滴入试剂边 称量，每加入一种试剂要充分搅拌后再加另一种试剂。盛树脂的烧杯要烘干，树脂配制好后，盛树脂的烧杯要用塑料纸封口，防止 树脂吸湿。树脂要随配随用，配制好树脂只能在冰箱中存放2天。通常每一个样品需要用45ml树脂，按样品数计算总量，分二次配制，一 次在浸渗开始时配制，另一次在最后一次更换纯树脂时配制。四、操作步骤.材料的固定(1)管瓶编号：根据固定样本数编写管瓶号码。(2)前固定：用双面刀片将植物材料(小麦的幼嫩根)切成1mm厚的薄片， 把薄片放入盛有12ml前固定液的管瓶中，固定时要将管瓶盖盖紧。将管瓶放 在振荡机上低速振荡3h

9、左右。(3)清洗：吸去管瓶中的前固定液，加入12ml缓冲液于管瓶，将管瓶放在 振荡机上低速振荡，10min后吸去缓冲液。共清洗3次，每次10min。(4)后固定：清洗后，管瓶中加入0.5ml后固定液。振荡固定3h左右，使固 定材料逐渐变黑。后固定过程也可在冰箱中进行(即过夜)。3 .脱水：所谓脱水，就是用乙醇或丙酮等有机溶剂浸渍已固定的材料，逐步除去 样品中的水分。脱水过程(1)用吸管吸去管瓶中的后固定液，用缓冲液或重蒸水清冼管瓶和固定的材 料三次，每次10min。(2)用20%、40%、60%、80%、90%、95%的乙醉分别浸渍固定的材料，每种浓 度处理2030min。(3) 100%乙醇

10、浸渍材料3次，每次30min。3 .置换：指一种溶剂更换另一种溶剂的过程。(1)在管瓶中加入2ml无水乙醇和1ml环氧丙烷(alc:P027:3),处理材料 10mi n(2)向管瓶中追加1ml环氧丙烷(使alc:P0七5:5),处理材料10mino(3)向管瓶中再追加2ml环氧丙烷(使alc:P03:7),处理材料10min。(4)倾倒出管瓶中的无水乙醇和环氧丙烷混合液，加入纯环氧丙烷3次，每 次 10m i n o在置换过程中管瓶要盖紧盖子，一防环氧丙烷挥发使样品干燥，二除空气中 湿气进入有机溶液。4 .浸透：指树脂替换有机溶剂的过程。(1)在管瓶中加入1ml环氧丙烷，向内滴入1滴Spur

11、r树脂，将管瓶放在振 荡机上低速振荡12h。(2)向管瓶中追加1至数滴Spurr树脂，使Spurr树脂的浓度逐渐提高，每 滴加一次Spurr树脂，振荡12h,共滴加0. 3ml左右的树脂，使树脂浓度达到 25%左右。(3)用吸管吸去管瓶中0.50.8ml的环氧丙烷和Spurr树脂的混合液，然后 加入纯Spurr树脂0. 5ml,使树脂浓度达到50%60%左右，振荡23h。(4)用吸管吸去管瓶中的环氧丙烷和Spurr树脂的混合液，加入0. 50. 8ml 的Spurr树脂，振荡23h。(5)更换新配制的Spurr树脂1ml,振荡12h左右。5 .包埋与聚合：指材料在树脂中定位和树脂固化过程。(1

12、)调温：先将恒温箱调至温度至70,包埋模事前烘干置干燥器中存放。(2)浸透：在包埋模的中放上已浸透的材料，用滴管吸取新配制的Spurr树 脂，并注满每个穴孔，用镶子拨正样品的方位。(3)聚合：将包埋样品的包埋模放入70恒温箱中聚合，12h后取出置干燥 器中存放。6 .修块：使样品显露出树脂，成为易于切片的状态(1)切块粘合 将钳子夹住样品块，用小钢锯把样品块切割，并将切割后的 样品块与树脂块用铁砂皮磨平，然后用501胶将在一起。(2)磨块 用锂刀或铁砂皮磨(粘合好的)样品块，使样品稍稍暴露，使待切 部位呈方形或长方形，最后用刀片将样品块的磨面切平.7 .玻璃刀制作：用玻璃制刀机先将玻璃条制成边

13、长为25mm的正方块，然后再将 每正方块制作成2把玻璃刀。为了使璃制刀上口能注水浮切片，还需用制刀用的 胶带和石蜡制作盛水用的“小舟”。8 .切片实验一、氧电极的使用及灵敏度的标定实验二、叶片光合放氧速率的测定实验三、植物组织中H2O2酶活性的测定第二部分 摄影技术和树脂切片的制作实验四、显微摄影与科技摄影实验五、数码显微图像显示装置显微摄影中的应用实验六、树脂切片的制作及植物材料的电镜观察第三部分幻灯片的制作实验七、黑白幻灯片的制作及调蓝工艺第四部分 用虫荧光素酶法测定植物组织中的ATP含量实验八、植物叶片中ATP含量的测定第五部分蛋白质与酶的实验实验九、植物组织中SOD活性的测定第六部分免

14、疫酶技术实验十、酶联免疫吸附测定（间接ELISA）第七部分其它实验十一、红外线CO2分析仪测定呼吸速率实验十二、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离植物的同工酶实验十三、植物组织中可溶性糖和淀粉含量的测定实验 十四、叶绿体色素和黑米色素的吸收光谱(1)固定样品块和玻璃刀 将样品块和玻璃刀固定在切片机上，避角约为5 度，样品头平放时，玻璃刀刀口与样品块处于同一高度。调节玻璃刀前后位置， 使刀口接近样品块。(2)荒切 用注射器向玻璃刀的“小舟”中注水。然后开动切片机，调节进刀 距离和速度，让玻璃刀荒切样品块，使样品块的切面逐渐平整光滑起来。切下的 树脂片会漂浮在“小舟”的水面上。(3)切片 当样品块的切面平整光

15、滑后便可正式切片。正式切片前应把漂浮 在“小舟”水面上荒切片去除。作为光镜观察用的半薄切片厚度一般控制在1um 左右。9 .贴片：将切片固定到载玻片上的过程当“小舟”水面上有理想切片时，用被烧结过的呈圆头玻璃小棒去沾附切片， 并把切片释放到滴有水滴的载玻片的水滴上，然后将载玻片放到电热板上烤片， 当载玻片上的水滴被烤干时切片就被贴在裁破片上。10 .染色：给切片染色和清洗的过程。在载玻片的切片的部位上滴加0.5%1% TB0,并把载玻片放到电热板上烤 片，待染色剂烘干后即用蒸倒水冲洗。并再次把切片烘干。五、植物材料的电镜观察.仪器及试剂扫描电镜可对金属、陶瓷、矿物、岩石、生物等样品以及各种固体

16、材料进 行观察和分析研究。X-射线能量色散谱仪，简称能谱仪(EDS),可进行微区的常 量元素定性和定量分析。能谱分析方法制样简单，不损坏样品，是微区成分分 析的有力工具。附有X射线能谱仪的扫描电镜已广泛地应用于物理、化学、材 料、地质、地理、生物、医学等学科以及冶金、陶瓷、电子、半导体等工业。前固定液2. 5%戊二醛、后固定液1%饿酸、乙醇、丙酮、银子、刀片、管瓶、 滴瓶等.扫描电镜标本制作4预冷的2. 5%戊二醛固定载片，1%饿酸后固定，系列乙醇一丙酮脱水，临 界点干燥，喷碳、喷金后，20kv下观察。六、结果与分析实验结果经数码相机的拍摄如图所示。切片过程中，由于玻埔刀的缘故导致 切片稍有刀

17、痕；烤片过程中，由于染料和温度的缘故导致切片染色不好。扫描电 镜制作过程中：首先应注意材料的固定要清洁，不能有污染，否则会影响实验结 果；其次系列乙醇一丙酮脱水时要注意时间的把握。整个过程要仔细谨慎。油菜雌蕊子房壁的切片图a.表皮b.薄壁细胞c.筛管d.导管e.细胞核f.药室内壁穗分化过程的电镜观察 第三部分实验七、幻灯片的制作一、实验目的及意义幻灯是现代视听系统的一个重要部分，学术报告和课堂教学配合放映幻灯， 能使听者加深对报告和授课内容的理解。幻灯片体积小、重量轻、便于携带、使 用方便，因此被广泛应用于各种场合，如会议、学术报告、课堂教学等。工作中 有时要放大图表，也可把图表先拍摄下来，制

18、成黑白幻灯，通过放映把原稿投影 在所画的纸上，然后描迹画图。图表的放大倍数可通过调节幻灯机与纸之间的距 离而达到。制作幻灯片是一项很实用的技术，个人掌握了，会给自己的教学和科 研工作带来许多方便。本试验主要介绍（1）用8din黑白电影下片制作单色彩幻灯片，此过程通常 由拍摄、冲洗和调色三个步骤组成。其原理与传统摄影的拍摄冲洗及照片的调色 基本相同，只是在操作方法上有所差异。（2）影像反转法制作黑白幻灯片，其原 理是先用显影剂将已感光的银通过化学反应还原为金属银，然后将之经漂白除斑 洗去，而未感部分的银盐保留下来，再经暴光等处理使保留下来的银盐部分转变 为由银组成的影像。二、实验器材1、基本设备

19、：135型单镜头照相机、翻拍架、近摄镜或近摄镜圈、光源、暗袋、冲洗罐、 天平、烧杯、试剂瓶、磁力搅拌器。2、稿件：图表、文字3、消耗品：8DIN胶卷、片平夹。4、试剂：D72显影液（8DIN片显影）、停显液、F5定影液（胶卷专用）、漂白液、 调蓝液等三、实验步骤（一）、用影像反转法制作黑白幻灯片1、稿件准备：黑白图表、文字与照片，稿件的设计要求其长宽比例为3:2。2、拍摄：8DIN正片、海鸥相机、光源4*12W、光圈3.55. 6之间，曝光1/2 秒（图表与文字），1秒（照片）。3、第一次显影：显影液1, 20C, 4min左右。4、水洗：35min5、漂白：漂白液，20。0, 4min6、水

20、洗：3-5min7、除斑：除斑液，20久，约3min,若不能除净，另加新液处理。8、水洗：35min9、再曝光：胶片置白光下1min以上充分曝光。10、第二次显影：D72,显至适度（20,时间约为35min）。11、水洗：35mino12、定影：F5, 20,约 3min。13、水洗：20min左右。14、晾干：置通风无尘处。过程37可在安全灯下操作，812步可在灯光下操作。（二）、蓝底白字单色幻灯片的制作1、拍摄：胶卷：8DIN,光明：5.6-8,曝光：1/2秒2、装卷：罐装胶卷3、显影：D72 （原液1/2浓度），20BC, 4min左右4、停显：5B-1 0.5min5、定影：F5 20

21、, 15min6、水洗：30min左右7、调蓝：调蓝液25, 1075min8、水洗：15min9、漂白：漂白液20, 1min左右10、水洗：15min11、透明：15%硫代硫酸钠201min左右12、水洗：20min左右13、晾干：悬挂在通风阴凉而无尘处晾干。四、实验结果影像反转法制作的黑白幻灯片:调蓝技术制作的蓝底白字单色幻灯片:第四部分实验八、植物叶片ATP含量的测定一、实验目的与意义生物为了维持其生命活动和执行各种生理功能都需要消耗能量，ATP是一种 可以直接被生物利用的含能物质，它在储存、输送和释放能量过程中，在调节若 千代谢环节中起着重要的作用。它是研究生物体生命活动和各种生理功

22、能的重要 内容。利用荧光素酶系的方法测定植物组织中ATP的含量是目前最灵敏、最专一 的方法之一。荧光素酶系发光机制可归纳为两步：1、荧光素的活化：荧光素(LH2)经荧光素酶(E)与ATP发生腺昔酰化而 被活化。腺昔化的荧光素与荧光素酶相结合，形成一个复合体 (E - LH-AMP)放出焦磷酸(PPi),反应需Mg?，的参与。MgE+LH2+ATPE LH? -AMP+ PPi2、氧化作用：E-LHAMP复合体被分子氧氧化，导致荧光素的电激发，当 荧光素从激发态回到基态时，发射荧光。E - Mg*ATP+ LH2AMP+PPi+L+hv二、实验仪器和试剂.实验仪器：FG300发光光度计、沸水浴锅

23、、高速台式离心机、天平、玻璃研 磨器、剪刀、移液管、试管、注射器、比色杯1 .试剂：1mg/ml荧光素酶系干粉；1 |i g/ml荧光素；测定介质；ATP标准液三、方法与步骤1 .ATP的提取：用镶子夹住2g叶片，放入100水蒸汽中20秒后取出，放入玻 璃研钵中，加5ml提取介质进行研磨，吸取2ml提取液放入离心管中，在16000 转/分钟的转速下离心5分钟，然后取上清液进行测定.测定：将样品室旋钮拨至开，打开样品室盖，将放有测定样品或ATP标准液 的比色杯放入样品室中，盖好样品室盖子，旋钮拨至关。开启记录开关，拨动走 纸速度调节杆，调节适宜的走纸速度(20mm/min),记录信号。然后取出样

24、品或 ATP标准液。3、计算：按下式计算样品液中ATP含量：样品液的发光强度义标准液浓度(mol/ml)样品液中ATP含量(moI/mI)二标准液的发光强度按下式计算叶片中ATP含量:样品液中ATP含量金）l/ml） X提取液总量（51）叶鲜重（2g）叶片中ATP含量（mol/g鲜重）=四、实验结果（附实验记录）样品液中 ATP 含量= 15. 9*10 ”/5. 4 =2. 944*10 （mol/ml） 叶片中 ATP 含量=2. 994*10-11*5/2 =7. 36*10-11 （mol/g 鲜重）注：材料为白玉兰叶片。实验结果如记录纸所示，经数据计算我们可得出此结论：测试材料白玉兰

25、叶 片中ATP含量较高。白玉兰叶片ATP含量测定结果的扫描图第五部分实验九、植物组织中SOD活性的测定一、实验目的与意义超氧物歧化酶是需氧生物中普遍存在的一种含金属的酶。它催化超氧物阴离 子自由基歧化产生水和氧气，与过氧化氢酶、过氧化物酶等共同构成保护酶体系， 清除具有生物毒性的活性氧。植物在衰老过程中，以及受到干旱、水涝等胁迫，组织SOD活性下降，导致 体内自由基累积，使植物受到伤害。因而，SOD活性可以作为植物抗衰老、抗逆 境能力的一种生理指标。二、实验原理检测SOD常用间接的化学方法，在反应系统中，既有Oz （如核黄素照光）产 生体系，又有被。2氧化或还原后可检测的物质（如NBT）,通过

26、光谱吸收，测定 被0氧化或还原后物质的变化，从而计算出SOD的活性。氮蓝四锂光化还原的 方法常用于植物组织的SOD活性测定。核黄素水溶液在照光条件下产生自由基，能将硝基氮蓝四噎（NBT）还原成 篮色化合物，后者在光波560nm处有最大吸收。S0D作为自由基可抑制该反应。 通常把抑制反应（将硝基氮四锂的还原抑制到对照的50%）所需酶量为一个活性 单位。三、仪器与试剂1、仪器设备分光光度计（如图）、低温高速离心机、试管等。722光栅分光光度计I.数字显示器；2.吸光度调零旋钮；3.选择开关；4.吸光度调斜率也位器；5.浓度旋钮;6.光源室；7.电源开关；8.波长手轮；9.波长刻度窗；10.式样架拉

27、手；11.100%T旋钮;12.0%T旋钮；13.灵敏度调节旋钮：14.干燥器2、试剂14.5mmol/LdI-甲硫氨酸、50mmol/LpH7.8 磷酸缓冲液、3umol/LEDTA 2.25mmol/LNBT、60umol/L 核黄素 四、实验步骤 1、粗酶液的提取取1克幼嫩叶片加于5倍于样品量的磷酸缓冲液，研磨过后用纱布过滤，并 以10000转/分钟离心，上清液为粗酶液，定容至10ml。2、酶活性的测定在盛3nli反应混合液（在5mli4. 5mmol/Ldl-甲硫氨酸中分别加入均以 50mmol/LpH7.8 磷酸缓冲液配制的 3umol/LEDTA、2.25mmol/LNBT 和 6

28、0umol/L核黄素，各溶液均在用前配制，遮光放置）的试管中加入适量的 SOD粗酶液，混合后放在透明的试管架上，经光照10min后迅速测定0D560 值，以不加酶液的试管为对照。3、计算SOD 活性二（Ao-A5） *V2/ A0*0. 5*Fw*V,Ao对照管照光后的光吸收值Ab样品管光吸收值5样品提取液体积（ml）Fw样品鲜重（g）Vi加入酶液体积（ml ）五、结果与计算测得 As 的 ODo 为 A=0. 325 , Ao 的 0D0 为 Ao =0. 685SOD 活性二（A。-A，*V2/ Ao*0. 5*Fw*Vi= (0. 685-0. 325)*10/0. 685*0. 5*1

29、*0. 1二105. 12 (活力单位/g鲜重)注：材料为葛苣幼叶。第六部分免疫酶技术实验十、酶联免疫吸附测定（间接ELSA）一、实验目的和意义酶联免疫吸咐测定是当前应用最广、发展最快的一项技术。其基本过程是将 抗原（或抗体）吸咐于固相载体，在载体上进行免疫酶染色，底物显色后用肉眼 或分光光度计判定结果。这一实脸的建立被认为是血清学试验的一场革命。二、实验原理 酶是一种有机催化剂，能反复作用，少量的 酶即可导致大量的催化过程，极为敏感。在催化 作用中呈现颜色反应。免疫酶技术的基本程序是 将酶分子与抗体分子结合，此种结合既不改变搞 抗体的免疫反应活性，也不影响酶的生物化学活 性。此酶标记抗体可与

30、存在于组织细胞或吸附于 固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加 底物溶液后，底物可在酶作用下水解呈色，或使 底物的溶液中的供氢体由无色的还原型变为有色 的氧化型，呈现颜包反应。因而可借底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应。颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原 的量呈正比。此种有色产物可用肉眼或在光学显微镜或电子显微镜下看到，用酶联免疫仪（如图）以测定。三、实验步骤1、纯化抗原2、以50-100ug/孔量加入酶标记板孔中3、置4C过夜或是37C吸附3小时4、PBS洗三次，每次5分钟以上（振荡）5、每孔200ulPBS/NCS4过夜或是37C封闭5小时6、PBS洗五次，每次5分钟（包被板-2

31、（）C或4C保存备用）7、每孔加入50-1 OOul第一抗体，同时设阳性，阴性对照8、37C孵育2小时。9、PBS洗5 次，每次5分钟。10、 每孔加入50-100ul酶标第二抗体。11、 37C孵育2小时。12、 PBS洗5 次，每次5分钟。13、 每孔加OPD底物lOOuio14、 37C避光作用102（）分钟。15、 以2MH2so4终止反应。第一部分氧电极的测氧技术及其应用实验一、氧电极的使用及灵敏度的标定一、实验原理薄膜氧电极(又称Clark电极)与其配套装置测定溶液中氧浓度，具有以下 特点：可测定 0.01 umol/L02o1-10秒/响应。仪器调试后操作方便。(1)灵敏度鬲(2

32、)反应速度快(3)操作方便它不仅可以测定反应体系的吸氧与耗氧的数量，还可以追踪氧变化的动态过 程，并能研究某些试剂与环境条件对体系放氧或耗氧的影响。因此，在生物科学 研究中被广泛应用。氧电极是测定溶液中含氧量的一种极谱电极，它由两个氧电极组成：一个是 销电极，作为阴极，另一个是银电极，作为阳极。销电极面积较小，而银电极面 积较大，两极浸在KC1电解质溶液中，氧电极覆盖能透过氧分子的薄膜。利用氧 在阴极上首先被还原的特性测定溶解氧。当两个电极之间未加极化电压时，回路 里几乎没有电流通过，当外加一个极化电压时，则氧分子在铀电极上得到电子， 被还原。在阳极上银被氧化。在不同的湿度和实验条件下，仪器的

33、灵敏度是不相同的，就会影响到测定结 果。一般在观察反应系统耗氧或放氧反应的相对变化时不需作定量氧浓度的标 定，只需调节仪器的灵敏度。而在测定氧浓度的绝对数量，或进行放氧或耗氧速 率测定时，则需进行灵敏度的标定。在一定的大气压和温度下，水中饱和的溶解 氧是一个常数，所以灵敏度标定可用水中溶氧量进行标定。二、实验器材和药品.器材：整套测氧装置(如图)包括氧电极、反应杯、电磁搅拌器、电极控制器、 自动记录仪、超级恒温水浴、光源等。1 .药品：无水亚硫酸钠。整套测氧装置1.光源(幻灯机)2.反应杯3.氧电极4.超极恒温水浴器5.电触点温度计6.电动搅拌器具7.自动记录仪8.氧电极控制器9.电磁搅拌器三

34、、实验步骤四、实验结果分析颜色改变深度及程度与被测样品中抗体含量有关，样品含抗体愈多，出现颜 色愈快愈深。阳性颜色深，阴性颜色浅，当样品颜色比阴性对照深时，即为阳性 或假阳性。用酶联免疫仪测得实脸结果如图，数据从左到右分别为：0.0010.0310.0770.1500.2730.2980.3120.3210.381().0000.0250.0670.1520.2740.298().315().3280.390分析：实验中被测样品中所加抗体含量是从左往右递增的，实验结果也表 明颜色是从左往右加深，符合实脸原理。第七部分其它实验十一、红外线C02分析仪测定呼吸速率一、实验目的与意义红外线C02分析

35、法是分析C02最有效的一种手段，它具有灵敏度高、反应迅 速、抗干扰性强、操作方便，可以进行活体的、连续的测定等突出优点，因而被 广泛应用于农业测定和科学研究中。在植物生理学研究中，常用红外线co?气体 分析仪进行植物光合速率、呼吸速率、光呼吸速率的测定，还可用于植物体内 co2浓度分析和水稻开颖的监测。二、实验原理不同分子结构的各种物质具有对光波选择吸收的特点。当用一束具有连续 波长的光照射分子时，分子会选择吸收某波长的光而产生能量跃迂。有异原子组 成的气体分子，由于组成气体分子各元素的电负性不同，电荷不重心，分子内部 处在不停的运动中，构成分子的原子之间的相对位置不断发生周期性变化。当用 一

36、束具有连续波长的红外光照射这一气体分子时，该气体分子就吸收一部分与其 振动频率相同的光能，并转变为分子的振动能和转动能，从而在光谱上形成吸收 峰。三、仪器和试剂FQ型红外线气体分析仪、剪刀、植物材料等四、实验步骤1、红外仪预热，调试及定好灵敏度2、开启气泵空气经钠石灰管进入红外工作气室，转动调零旋钮，把记录笔 移至左端，记录零气基线2分钟，然后关闭气泵3、将待测材料放在磨口玻璃瓶内，开启气泵，稳定后开启记录笔记录C02 峰，然后关闭气泵与记录笔4、取出材料，开启气泵，稳定后开启记录笔，使记录笔退回基线处。5、称材料(草坪草)鲜重1.23克。五、计算A=ALXSXF XK/WA:呼吸速率(mg

37、C02 - g-1FW h-1) L:记录纸上空气基线到测量点的距离(6cm)S:灵敏度(3uI/I cm)F:气体流量(401/h)K: CO2 密度(mg/ul)K=44X273X/22400/ (273 + t) =1.79X10-3(mg/uI)W:鲜重(g)六、实验结果(附实验记录)贝”:A=6*3*40*1.79*103/1.23=1.048 (mg C02 - glW h )实险结果如记录纸所示，当待测材料(草坪草)放入磨口玻璃瓶内后，记录纸上 出现一个CO?释放峰，是因为CO?气体分子吸收一部分与其振动频率相同的光能， 转变为分子的振动能和转动能，从而在光谱上形成吸收峰。红外线

38、C02分析仪测定呼吸速率结果图实验十二、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离植物的同工酶一、实验目的和意义同功酶专指受遗传体系决定的酶的不同分子形式。从作用上看，分子形式 不同的酶能做一样的工作，即催化同样的生化反应，所以把同功酶改称为同工酶。 由于蛋白质分子的结构归根结底是由基因的DNA分子结构决定的，因此，同工酶 就成为鉴定生物基因型是否有差别的可靠指标，在遗传育种，生长发育，物种起 源，生理卫生等领域的研究中成为一种重要的工具；此外，同工酶还与植物病害 有一定联系，可用来鉴定抗病的强弱。本实险的实验目的主要是掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分析植物的同工酶的原 理及方法、步骤。另外通过联苯胺染色法分析过氧化物同

39、工酶。二、实验原理分离同工酶的方法有：电泳法、层析法、酶学法和免疫学其中以电泳法最为普遍，电泳法中又以垂直平板聚丙炸酰胺凝胶电泳分辨率为最好。聚丙烯酰胺 凝胶电泳有三种物理效应：1、样品的浓缩效应；2、凝胶的分子筛效应；3、一般的电泳分离的电荷效应。由于同工酶的酶蛋白分子的大小和结构不同，携带的电荷种类和数量不同，所以 可用凝胶电泳将它们一一分开。在适宜酶催化反应的条件下提供酶作用的底物， 再利用特殊的显色反应以显示产物的形成或底物的消失，就可以看到经电泳分离 后的同工酶谱带。同工酶的鉴定过程通常如下：1、从植物样品中提取粗酶液；2、聚丙烯酰胺凝胶电泳把样品中酶带分开;用专一作用底物和特殊染料

40、把需要分析的酶染色，显示同工酶酶谱。三、实验器材与试剂下忙棺下忙棺1 .器材：高速离心机、电泳仪、电泳槽、长 针头注射器、植物材料等.试剂：甲叉双丙烯酰胺(Bis);丙烯酰胺 (Acr);四甲基乙二胺(TEMED);过硫酸柱；核黄素(VB2);三羟甲基氨基甲烷(Tris); 蔗糖；甘氨酸；盐酸等垂直板电泳装置图2 .试剂的配制：(1)凝胶系统(制胶时使用比例为浓缩胶：4a: 5: 6: 7=1: 2: 1: 4 分离胶：1: 2a:水：3= 1: 2： 1： 4)溶液号12 a34a567组分 /100ml1mol/lHCl 48ml Tris36.3g TEMED 0.46mlAcr 28.

41、 0g Bis 0. 735g过硫酸 铁 0.14g1N HCI 48ml Tris 5.98gTEMED 0. 46mlAcr 10. 0g Bis 2. 5g核黄素4. Omg蔗糖40. 0gPH值8.986.76.7(2)电极缓冲液：Tris 6. 0g ;甘氨酸28. 8g;加水至1L。使用时稀释至 10%o(3)显色液：0. 1g联苯胺加5ml无水乙醇，再加10ml 1.5mol/L乙酸钠及 10ml 1.5moi/L乙酸，加蒸僚水75m1,染色前加56滴H2O2原液。四、实验步骤：1、样品的提取1g样品+5-6ml提取介质，分别取油菜花、小麦叶片各3g,放预先冷却的研 钵内在冰浴中

42、研成匀浆，16000转/分冰冻离心5分钟，取上清液作为酶的粗提 液，冰箱中保存。2、电泳胶的制备垂直板电泳槽安装好后，首先按上述比例配置分离胶，灌入板中，而后用水 封胶。待分离胶聚合后，吸去上部的水，配制浓缩胶，灌入板中，插下梳子，在 光下聚合。3、点样与电泳把制好的胶板安装在电泳槽上，上下电泳槽注满在冰箱中预冷的电极缓冲 液，用微量进样器吸取酶的粗提液10 U I,插入样品孔底部，慢慢注入，并记录 好三种样品号码。在上槽电极缓冲液中加入0.01%;臭酚兰指示剂数滴，在将电泳 槽置于冰箱内进行电泳，时间大约3个小时。当指示剂移动到离下层电泳液水平 面1 cm处，即可关闭电泳，停止电泳，卸板。4

43、、染色将凝胶漂洗后，放入联苯胺染色液，稍加振动，可显示出蓝色酶带，待酶带完全出现后，用水清洗，进行测量，并扫描成图。棉花 水稻 玉米五、结果与分析（附实验记录）实脸中可见垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳有以下优点：误差小；点样数可 变动；凝胶可长期保存；显色和摄影都较方便。实脸结果：由于同工酶的酶蛋白 分子的大小和结构不同，导致形成一条一条的同工酶酶谱带电泳扫描图实验十三、植物组织中可溶性糖和淀粉含量的测定一一硫酸葱酮法一、实验目的和意义可溶性糖和淀粉是粮食作物、蔬菜和水果中C素营养的主要营养物质。糖类 作为呼吸基质，为植物的各种合成过程和各种生命活动提供所需的能量，因此通 过测定植物组织中可溶性糖

44、和淀粉的含量可以在一定程度上了解植物各组织器 官中的营养状况。测定植物组织中可溶性糖的方法有苯酚法、意酮法；测定植物组织中淀粉含 量方法有酮法、双波长法、农业部法和国标法。二、实验方法原理（硫酸点:酮法）淀粉是由葡萄糖残基组成，在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖，然后在浓 硫酸的作用下，使单糖脱水生成糠醛类化合物，利用葱酮试剂与糠酸化合物的显 色反应，即可进行比色测定。1实验方案高氯酸（2次次取）慈酮试剂样品中淀粉1-匚葡萄糖二二海醛类化合物80%乙醇 _，葱酮试剂样品可溶性糖匚二 浸提液,糠醛类化合物2显色原理可溶性糖类遇浓硫酸，就会脱水形成羟甲基糠醛，羟甲基糠醛与意酮再脱水, 形成蓝绿色的糠

45、醛衍生物，其颜色深浅与含糖量高低成正相关。该蓝绿色在 620nm波长处有最大吸收值，故可进行比色测定。己糖 亍羟甲基糠醛糠醛衍生物（蓝绿色） 浓硫酸 水 慈酮一水（本法适于测定己糖、蔗糖和可溶性淀粉）3仪器药品（1）仪器：分光光度计；天平（万分之一）；离心管（4000转/分）；恒温水浴；容量瓶； 试管（25*200mm）;移液管（5、1、0.5ml）;量筒；水浴锅；电炉；漏斗；滤纸。 （2）药品：80%乙醇；标准葡萄糖（100ug. IT）：准确称取100mg分析纯无水葡萄糖， 溶于蒸馆水并定容至100ml,使用时再稀释10倍；意酮试剂：称取200mg：g酮， 溶于100ml浓硫酸（比重1.8

46、4）中，冷却至室温，贮存在棕色瓶内，当天配制 当天使用：9. 2mol. 1-1和天6mol. 1-1高氯酸。4测定方法（1）样品中可溶性糖提取对于淀粉含量高的样品，要用80$的乙醇提取。称取0.1g粉碎过100目筛 的烘干样品，置于10ml离心管中，加入6-7ml 80%乙醇，在80水浴中提取30 分钟，取出离心（3000转/分）5分钟，收集上清夜。重复提取以上两次（各10 分钟）同样离心，收集三次上清液合并于25ml容量瓶，以80%乙醇定容，供可 溶性糖的测定。（2）样品中淀粉提取向沉淀中加水2ml,搅拌均匀，置于80,C水浴中使残留的乙醇蒸发，再放入 沸水浴中糊化15分钟。冷却后，将离心管放在冰水浴中，加入2ml冷的 9. 2mol.LT高氨酸，不时搅拌，提取15分钟后加水4ml,混匀离心10分钟，上 清夜倾入50nli容量瓶。再向沉淀中加入2ml 4. 6mol.L-1高氯酸，搅拌提取15 分钟后加入水6ml,混匀离心10分钟，收集上清夜于容量瓶。然后用水洗沉淀 1-2次，离心，合并离心液于50ml容量瓶用蒸馅水定容供测淀粉用。（3）绘制标准曲线取6支大试管，分别按下表加入各试剂:管号（ml） 试剂空白12345样品（测糖）样品（测淀粉）箭萄糖