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1、“紫外-可见分光光度法测定药材的多糖含量”开放性实验的设计*李燕，严万莉，曾紫微，肖竦，何彬（贵州医科大学,贵州 贵阳550025）近年来，国家高度重视创新型人才的教育和培养口。大学生毕业出 来是服务于社会，引领社会的发展的，所以国家一直致力于培养创新 型人才。但是不得不承认，许多高校的发展落后于社会的发展，在科 技技术不断进步的今天，各大企业有了更新的运营模式，更新的仪器 设备，而大多数高校仍然在传授多年前就很成熟的各种理论知识，而 本来就少的实验课也是“照葫芦画瓢”，只要跟着书本实验步骤做， 基本不会出错，从各方面来说，都是不利于社会的发展的2。特别 是药学专业的学生，不仅要求学生掌握扎实
2、的基础和较广的知识面， 还需要具备较强的创新意识，这样才能适应大学毕业以后，成为复合 型的高素质的药学人才，从事药学相关的研究开发、教育及质量控制 等方面的工作，服务于国家经济社会建设主战场。传统的教学模式虽然能达到教学的目的，但是“照本宣科”式的教学, 容易忽视学生分析问题、解决问题的能力和创新能力的培养3。虽 然，药学专业课程设置包括了众多科目的基本理论知识以及实验课程, 然而，大部分实验课程均为基本的单元操作实验，极少涉及综合性实 验或者自主创新实验；大部分实验也与社会实际工作内容相距甚远。 现有实验课程与药学专业学生的培养目标还有一定的差距和不足，有 必要进行一些新的实验教学改革和尝试
3、。为了提高药学教育的实验教 学质量，我们设置了不同类型的开放性实验，让学生自主学习、自主 操作的能力得到提高。本文提出针对多种中药材的多糖含量测定设计 开放性实验，以培养学生发现、分析、解决问题的能力。多糖通常指的是10个以上的单糖通过昔键共价连接的一类生物大分 子代谢物，在多种中药材中，都含有多糖。最初，人们认为多糖的活 性不强，在制备中药提取物的过程中，多糖常常作为杂质被除掉。20 世纪70年代以后，许多研究发现多糖广泛参与了细胞生命的生理调 节，在许多过程中都发挥了相当重要的作用：抗氧化损伤4-5、抗 癌抗菌6、抗炎7等。比如灵芝多糖就是灵芝中最有效的成分之一, 其具有多种药理活性，如提
4、高机体免疫力、抗肿瘤、抗辐射等作用8； 铁皮石斛多糖同样是铁皮石斛的主要有效成分之一，其除了有免疫调 节功能、抗肿瘤功能，还具有降血糖、抗氧化、抗衰老的作用9。 所以，对于不少中药材来说，其多糖含量也是中药材质量控制的标准 之一。本文以灵芝多糖为例，以紫外-可见分光光度法来测定灵芝多 糖的含量10,开展开放性实验。1实验设计1实验目的(1)培养学生自主学习、自主查阅资料的能力。培养学生熟悉紫外-可见分光光度计的原理和操作。培养学生掌握紫外-可见分光光度计法测定不同药材的多糖含量。1.2 实验原理与方法(1)原理紫外-可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸收了紫外-可见辐射 光后，发生了电子能级跃
5、迁而产生的吸收光谱。由于各种物质具有各 自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也 就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线, 可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该 物质的含量11。硫酸;酮法是测定多糖含量的较为常用的方法，其原理是：多糖类在 浓硫酸的作用下水解为单糖，然后迅速脱水生成糠醛衍生物，其与意 酮结合成有色化合物，而且在适当波长下和一定浓度范围内其颜色深 度(吸光度值)与单糖含量成线性关系，从而可以通过比色测定其多糖 含量12T3。(2)方法本实验采用了灵芝粉末，运用紫外-分光光度法来测定多糖的总含量。 以不同浓度无水葡糖为对
6、照品溶液绘制标准曲线，将灵芝供试品溶液 所测吸光度代入标准曲线中，计算出灵芝多糖含量。(3)仪器UV-2700紫外分光光度计；石英比色皿；移液管；分液漏斗；水浴锅； 分析天平；滤纸；干燥箱；洗耳球；漏斗；圆底烧瓶；冷凝管；具塞 试管；容量瓶。1.3 实验内容(1)供试品的前处理对于未粉碎的供试品，小于500 g时全部用切片机切片，混匀，用四 分法缩分至约100 g；送检样品大于500 g,混匀，随机分取500 g, 切片，混匀，用四分法缩分至约100 go缩分的样品置60 C烘箱中 干燥4h,粉碎，全部过三号筛，封装于塑料自封袋中，干燥处保存。 对于粉末供试品，全部过三号筛，不通过部分，粉碎，
7、过三号筛，封 装于塑料自封袋中，干燥处保存。对照品溶液的制备取无水葡萄糖对照品适量，精密称重，加蒸镭水配成每1mL含0.12 mg的溶液。标准曲线的绘制精密量取对照品溶液0.2 mL. 0.4 mL. 0.6 mL、0.8矶、1.0 mL、1.2 mL,分别置于10 mL带塞试管中，然后加蒸播水至2.0 mL,迅 速精密加入硫酸;I酮溶液（精密称取意酮0. 1 g,加硫酸100 mL使溶 解，摇匀）6 mL,立即摇匀，放置15 min后，立即置冰浴中冷却15 min, 取出，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法（通则0401）, 在625 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横
8、坐标， 绘制标准曲线。（4）供试品溶液的制备取本品粉末约2 g,精密称定，置圆底烧瓶中，加水60 mL,静置1 h, 加热回流4 h,趁热滤过，用少量热水洗涤滤器和滤渣，将滤渣及滤 纸置烧瓶中，加水60 mL,加热回流3 h,趁热滤过，合并滤液，置 水浴上蒸干，残渣用水5 mL溶解，边搅拌边缓慢滴加乙醇75 mL, 摇匀，在4 C放置12 h,离心，弃去上清液，沉淀物用热水溶解并 转移至50 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，取溶液适量，离心， 精密量取上清液3mL,置25mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。 多糖含量测定精密量取供试品溶液2 mL,置10 mL具塞试管中，照标准曲线制备 项
9、下的方法，自“迅速精密加入硫酸懑:酮溶液6mL”起，同法操作， 测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的含量，计 算，即得。打开紫外-可见分光光度计电源15 min以上；用相应的空白溶液分别洗涤两个比色皿各三次，在两个比色皿分别 加入空白溶液至比色皿高度的2/3以上；将两个盛有空白溶液的比色皿置分光光度计样品和参比光路上；在625 nni处进行调零；取出样品光路中的比色皿，用待测标准溶液润洗比色皿三次，加入 待测标准溶液至比色皿高度的2/3以上；在625 rnn处测定吸光度值；将测试集数据输入到作者身份识别模型中，运用MATLAB进行求解。 通过将作者身份识别模型中识别的电子邮件正
10、确数除以模型中总的 邮件识别数，得到邮件识别的准确率，以此来衡量研究的准确性。并 对程序运行的结果进行分析，得到该方法的识别准确率。绘制标准曲线（注：相关系数达0.99以上）；取出样品光路中的比色皿，用待测供试品溶液润洗比色皿三次，加入待测供试品溶液至比色皿高度的2/3以上，在625 nm处测定吸光 度值；从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖(C6Hl206)的量，计算, 即得。(6)多糖含量的计算取出样品光路中的比色皿弃去标准品溶液，用空白溶液洗涤样品比色 皿三次，再用待测供试品溶液洗涤样品比色皿三次，加入待测供试品溶液至比色皿高度的2/3以上，在625 nm处测定吸光度；记录并根据下式计
11、算灵芝多糖的含量：灵芝多糖的含量=(m X V1 * V3) / (V2XV4XW) X 10-6X100%式中：W代表精密称定灵芝细粉的质量，g； m代表测定的供试品溶液 的质量，ug; VI为供试品体积，mL； V2为量取供试品体积，mL； V3 为稀释后体积，mL； V4为量取稀释后体积，mLo1.4 思考题(2)思考选择在625 nm波长处测定吸光度的依据。如果灵芝供试品所测得的吸光度不在标准曲线范围内，应该采取 的措施。(4)比较紫外-可见分光光度法与HPLC法、以及其他方法的优缺点， 以及硫酸患:酮法和硫酸苯酚法的区别及其优缺点。如果要测定其他中药材，比如铁皮石斛和人参，尝试合理设
12、计实 验。2实验的可行性2. 1实验特点为了解决传统教学模式单一等问题，采取开放性实验来打破学生“被 动”吸收知识的困境，培养学生发挥积极的主观能动性和创新性。此次的开放性实验是关于中药材的多糖含量测定，多糖含量测定的实 验是具有其价值和意义的，多种中药材的多糖含量也是中药材质量控 制的标准之一，所以实验内容的选取是符合我们将理论知识运用于实 践的。根据糖的理化性质和化学性质，许多多糖含量测定方法被设计 出来，在一定范围内是可以达到测定的目的要求的。多糖含量测定方 法包括了比色法、滴定法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、 薄层色谱法(TLC)、高效毛细管电泳法(HPCE)等方法
13、。其中，比色法 使用最为悠久，也是目前最广泛的多糖含量测定方法，特别是意酮- 硫酸法应用最广泛。当然，针对中草药药材的多糖含量测定方法各有 优缺点，具体的多糖含量测定方法的选取需要根据选定药材的多糖及 其他化学成分的性质来决定。此外，多糖含量测定方法也会存在一些 挑战，比如，不同多糖含量测定方法的标准品的选择、最大检测波长 的选择、线性浓度范围、显色后的稳定性、显色时长、药材中各组分 之间的干扰等等问题。因此，在多糖含量测定的过程中应排除其他水 溶性成分的影响，特别是一些中性糖和酸性糖的相互干扰。总的来说, 以灵芝多糖含量测定为例，开展的开放性实验，本实验操作简单，但 需学生独立实验，熟知相关
14、理论知识和仪器操作，能让学生从理论知 识到实践的锻炼。2022年版中华人民共和国药典中收载了各种中药材的多糖含量 测定方法和相关的标准规定，包括灵芝、人参、枸杞、当归、玉竹、 铁皮石斛、昆布、黄精、海藻等多种中药材的多糖含量测定；也有大 量的文献报道了多糖含量测定的方法学研究。虽然，各种药材的多糖 测定方法不尽相同，但是，总的来说，基本上运用到的都是比色法原 理进行测定，即通过糖分子发生氧化还原反应以后，再与显色剂反应 生成有色化合物。这就要求利用标准品进行线性范围考查获得标准曲 线，在线性范围内的标准曲线区间，获得多糖含量在理论上具有非常 强的可行性。对于此次实验所用到的各种仪器，以及各种试
15、剂，均是 易得且实验室已具备的，方便学生随时可以操作。在实验过程中，针 对已提出的思考题，学生需要查询大量资料方能解决，帮助学生熟悉 理论知识，通过学生亲自配置对照品溶液、标准品溶液以及供试品溶 液等多个步骤，有利于提高学生的动手操作能力。在实验的过程中， 经过讨论，学生能熟练掌握紫外-可见分光光度计的工作原理及具体 操作步骤，动手能力与独立思考的能力明显提高，达到了开设开放实 验的目的。3结语开放性实验教学是实验教学改革和发展的内在要求，也是为了适应创 新型和应用型人才培养的时代需要，配合学校药学专业本科培养计划 的实施，深化实践教学改革，培养学生的创新意识和实践能力，进行 日常科研和教学工作的交叉融合，充分挖掘和优化资源配置，提高教 学质量。通过该开放性实验的开设，面向药学专业学生，我们为学生 提供了一个实验的平台，给学有余力的学生一个自主发展和实践锻炼 的机会，强调多学科知识点的交叉融合，强化基础，着眼应用，拓宽 学生的知识面，灵活了个性化教学的多样性。在实验过程中，学生可 以独立自主完成实验，掌握紫外-可见分光光度计的原理及操作过程, 提高学生实验的参与度，以及对实验的积极性，培养学生综合运用知 识的能力。经反馈，学生很认可这种开放性实验，收益很大，学生们 的动手能力、实验操作技能都得到了普遍的提高，并认为这种模式的 教学能让他们学以致用。