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1、专题 5 DNA 和蛋白质技术 课题 3 血红蛋白的提取和分离期末复习知识点期末复习知识点1.蛋白质蛋白质分离的理论依据：分离的理论依据：蛋白质各种特性蛋白质各种特性的差异，如的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附吸附性质性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。种类的蛋白质。2.分离分离蛋白质的方法蛋白质的方法（1）凝胶色谱法凝胶色谱法概念：也称做分配色谱法，是根据概念：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量相对分子质量的大的大小分离蛋白质的有效方法。小分离蛋白质的有
2、效方法。凝胶：是一些微小的多孔球体，这些球体大多数由多凝胶：是一些微小的多孔球体，这些球体大多数由多糖类化合物构成，糖类化合物构成，如如葡聚糖或琼脂糖葡聚糖或琼脂糖。在小球体内部。在小球体内部有许多贯穿的通道。有许多贯穿的通道。原理：当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，原理：当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，通过凝胶的移动速度较慢，通过凝胶的时间时间较长较长；相对分子质量较大相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，的蛋白质无法进入凝胶内
3、部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，路程较短，移动速度较快，通过凝胶的时间较短通过凝胶的时间较短。因此。因此可将各种相对分子质量不同的蛋白质分子分离。（原理见可将各种相对分子质量不同的蛋白质分子分离。（原理见右上图右上图）分离过程：蛋白质混合物上柱分离过程：蛋白质混合物上柱洗脱洗脱大分子流动快、大分子流动快、小分子流动慢小分子流动慢先收集大分子先收集大分子后收集小分子。后收集小分子。（2）电泳电泳概念：概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。原理：在一定的原理：在一定的 pH 下，多肽、核酸等生物大分子的下，多肽、核酸等生物大分子的可解
4、离基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些可解离基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。影响电泳速率的因素：待分离样品中各种分子影响电泳速率的因素：待分离样品中各种分子带电性带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。离。带电性质决定迁移方向，分子大小决定迁移速度带电性质决定迁移方向，分子大小决定迁移速度。方法：常用的电泳方法有方法：常用的电泳方法有琼
5、脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳胺凝胶电泳。A.琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的各种分子在电场中的迁移速率取决于各种分子所带电荷迁移速率取决于各种分子所带电荷性质的差异及分子大小、形状的不同性质的差异及分子大小、形状的不同，从而得以分离。，从而得以分离。B.聚丙烯酰胺凝胶电泳：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中聚丙烯酰胺凝胶电泳：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的的迁移率取决于它所带净电荷的多少及分子的大小等因迁移率取决于它所带净电荷的多少及分子的大小等因素素。为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加。为了
6、消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入入 SDS。SDS 能与各种蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质形成蛋白质SDS 复合复合物，物，SDS 所带负电荷的量大大超过了蛋白质所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小电泳迁移率完全取决于分子的大小。SDS-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶电泳中，小分子的移动速度快，大分子的移动速小分子的移动速度快，大分子的移动速度慢，分子向阳极移动。度慢，分子向阳极移动。注：在测定蛋白质分子量时注：在测定蛋白质分子量时通常使用通常
7、使用 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳。SDS 能使蛋白能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS 的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。是单条肽链的分子量。3.缓冲溶液缓冲溶液（1）作用：在一定范围内，作用：在一定范围内，抵制外界的酸和碱对溶抵制外界的酸和碱对溶液液 pH 的影响，维持的影响，维持 pH 基本不变基本不变。（2）配制：通常由配制：通常由 12 种缓冲剂溶解于水中配制种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同而成，
8、通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同 pH 范围内使用的缓冲液。范围内使用的缓冲液。4.蛋白质提取和分离一般分为四步：蛋白质提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定纯化和纯度鉴定。（1）样品处理样品处理血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。血红蛋血红蛋白由四条肽链组成，包括两条白由四条肽链组成，包括两条 肽链和两条肽链和两条 肽链肽链。其中每条肽链环绕一个其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团亚铁血红素基团，此基团可携带一，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含有。血红蛋白因含有
9、血红素血红素而呈现而呈现红色。注：血红蛋白呈现红色这一特点对进行血红蛋白质红色。注：血红蛋白呈现红色这一特点对进行血红蛋白质分离的意义：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离分离的意义：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液，这使时可通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液，这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。红细胞的洗涤红细胞的洗涤a.目的：目的：去除杂蛋白去除杂蛋白(如血浆蛋白如血浆蛋白)，获得纯净红细胞，获得纯净红细胞。b.过程：血样低速短时间离心过程：血样低速短时间离心吸出上层透
10、明黄色血吸出上层透明黄色血浆浆(含血浆蛋白含血浆蛋白)，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯加入五倍体积的生理盐水加入五倍体积的生理盐水再低速短时间离心再低速短时间离心重复三重复三次，直至上清液不再呈现黄色次，直至上清液不再呈现黄色得到纯净红细胞。得到纯净红细胞。注：注：为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂柠檬酸钠柠檬酸钠。生理盐水作用：能生理盐水作用：能保持红细胞渗透压稳定保持红细胞渗透压稳定而不至于破裂。而不至于破裂。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高和时间洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速
11、度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。血红蛋白的释放血红蛋白的释放a.目的：使红细胞破裂，释放血红蛋白。目的：使红细胞破裂，释放血红蛋白。b.过程：红细胞加蒸馏水到原血液的体积过程：红细胞加蒸馏水到原血液的体积加加 40%体积的甲苯体积的甲苯磁磁力搅拌器上搅拌力搅拌器上搅拌红细胞破裂，释放血红蛋白注：红细胞破裂，释放血红蛋白注：蒸馏水作用：使红细蒸馏水作用：使红细胞吸水涨破。胞吸水涨破。甲苯作用：加速红细胞破裂并释放出血红蛋白甲苯作用：加速红细胞破裂并释放出血红蛋白。分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液a.目的：经过离心使血红蛋白与其他
12、杂质分离开。目的：经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开。b.过程：混合液离心过程：混合液离心用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层分液漏斗中分液漏斗中静置片刻静置片刻分离出下层的红色透明液体。分离出下层的红色透明液体。试管中混合液离心后分为四层，从上往下数试管中混合液离心后分为四层，从上往下数：第第 1 层：无色透明的甲苯层；第层：无色透明的甲苯层；第 2 层层：白色：白色薄层固体，是脂溶性物质薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层；第的沉淀层；第 3 层：红色透明液体，是血红蛋白的层：红色透明液体，是血红蛋白的水溶液水溶液；第；第 4 层：层：暗红色的杂质沉淀层。暗红色的杂质沉淀层。
13、（2）粗分离粗分离透析透析目的：除去样品中相对分子质量较小的杂质。目的：除去样品中相对分子质量较小的杂质。原理：原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。在袋内。方法：将血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入方法：将血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入一定量适宜浓度的一定量适宜浓度的磷酸缓冲液磷酸缓冲液中，透析中，透析 12h。（3）纯化纯化凝胶色谱操作凝胶色谱操作目的：通过凝胶色谱法将相对分子质量不同于血红蛋目的：通过凝胶色谱法将相对分子质量不同于血红蛋白的杂蛋白除去。白的杂蛋白除去。过程过程a.凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作b.凝胶色
14、谱柱的装填：本实验使用的是凝胶色谱柱的装填：本实验使用的是交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶。干凝胶用蒸馏水充分溶胀，配成凝胶悬浮液。为了加速膨干凝胶用蒸馏水充分溶胀，配成凝胶悬浮液。为了加速膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至接近沸腾，这种方法不断节约时间，还可以除去凝胶中至接近沸腾，这种方法不断节约时间，还可以除去凝胶中可能带有的微生物，可能带有的微生物，排除胶粒内的空气排除胶粒内的空气。装填时可轻轻敲。装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。色谱柱内动色谱柱，使凝胶装填均匀。色谱柱内不能有气泡存在不能有气泡存在，一旦发现有气泡
15、，必须重装，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋一旦发现有气泡，必须重装，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。装填完后，立即用磷酸白质的洗脱次序，降低分离效果。装填完后，立即用磷酸缓冲液洗涤平衡凝胶，使凝胶装填紧密。缓冲液洗涤平衡凝胶，使凝胶装填紧密。c.样品的加入和洗脱：在色谱柱顶端滴加样品的加入和洗脱：在色谱柱顶端滴加 1mL 样品，样品，在在 50cm 高操作压下用高操作压下用磷酸缓冲液洗脱磷酸缓冲液洗脱，待红色的血红，待红色的血红蛋白接近色谱柱底端时用试管收集流出液，每蛋白接近色谱柱底端时用试管收集流出液，每 5mL 收收集一管。集一管。如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功作成功。注：洗脱过程中加入物质的量浓度为注：洗脱过程中加入物质的量浓度为 20mmol/L 的磷的磷酸缓冲液酸缓冲液(pH 为为 7.0)的目的是模拟生物体内的生理环境，的目的是模拟生物体内的生理环境，保持体外的保持体外的 pH 和体内一致，保证血红蛋白的结构和功和体内一致，保证血红蛋白的结构和功能稳定。能稳定。（4）纯度鉴定纯度鉴定对分离的蛋白质样品进行纯度鉴对分离的蛋白质样品进行纯度鉴定，使用最多的方法是定，使用最多的方法是 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳。谢谢谢谢