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1、课题课题3分解纤维素的微生物分解纤维素的微生物的分离的分离专题专题2 微生物的培养与应用微生物的培养与应用植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。植物每年产生的纤维素超过植物每年产生的纤维素超过70亿吨亿吨麻麻麻麻棉棉棉棉花花花花作用：作用：纤维素在造纸业中大量使用，是重要的纤维素在造纸业中大量使用，是重要的造纸造纸原料。原料。纤维素可以制成甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤纤维素可以制成甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、微晶纤维素等维素、微晶纤维素等衍生物衍生物。食物中的纤维素（即食物中的纤维素（即膳食纤维膳食纤维）对人体的健康也有着）对人体的健
2、康也有着重要的作用。重要的作用。纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类多糖类物质物质。纤维素纤维素（cellulose）组成：组成：纤维素是由葡萄糖组纤维素是由葡萄糖组成的大分子多糖。成的大分子多糖。纤维素结构式纤维素结构式纤维素结构式纤维素结构式淀粉结构式淀粉结构式淀粉结构式淀粉结构式植物纤维素植物纤维素植物纤维素植物纤维素焚烧秸秆焚烧秸秆焚烧秸秆焚烧秸秆草食性动物肠胃中的草食性动物肠胃中的共生微生物共生微生物。其。其原理是产生纤维素酶而分解纤维素，原理是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的
3、能力。而人没有分解纤维素的能力。草食性动物是怎样消化食草食性动物是怎样消化食物中纤维素的？物中纤维素的？纤维素是一种重要的碳水化合物，土壤纤维素是一种重要的碳水化合物，土壤中的某些微生物能将其分解利用。中的某些微生物能将其分解利用。纤维素分解细菌纤维素分解细菌纤维素分解细菌纤维素分解细菌纤维素纤维素纤维二糖纤维二糖C1酶、酶、Cx酶酶2、纤维素酶、纤维素酶纤维素酶是一种复合酶纤维素酶是一种复合酶组成组成 纤维素酶包括三种组成：纤维素酶包括三种组成：C1酶、酶、Cx酶、葡萄糖苷酶酶、葡萄糖苷酶纤维二糖纤维二糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶作用：作用：C1 C1酶、酶、CxCx酶将纤维素分解为纤
4、维二糖；酶将纤维素分解为纤维二糖；纤维二糖再由葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。纤维二糖再由葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶C1酶酶Cx酶酶C1酶酶葡萄糖葡萄糖纤维素酶活性的测定实验纤维素酶活性的测定实验：图图2-12 A2-12 A：未：未加入纤维素酶加入纤维素酶 B B：加入了纤维素酶：加入了纤维素酶滤滤纸纸崩崩溃溃法法 加入加入pHpH为为4.84.8、物质的量浓度、物质的量浓度为为0.1mol/L0.1mol/L的醋酸的醋酸-醋酸钠缓醋酸钠缓冲液：冲液：A A：11mL11mLB B：10mL10mL，再加入，再加入1mL1mL纤维素纤维素酶（酶（7080U/mL7080U/mL）将
5、二支试管固定在将二支试管固定在50mL50mL的锥形的锥形瓶中，在摇床上以瓶中，在摇床上以140r/min140r/min的的转速振荡反应转速振荡反应1h1h，观察结果。，观察结果。在一支试管中添加纤维素酶，在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；尽管另一支试管不添加纤维素酶；尽管醋酸醋酸钠缓冲液用量不同，但醋酸醋酸钠缓冲液用量不同，但都能维持相同的都能维持相同的pH。思考思考1实验分析：实验分析：P27的的小实验是如何构成对照的？小实验是如何构成对照的？我们已经学习了怎样从土壤中我们已经学习了怎样从土壤中分离分解尿素的细菌，你能自己动分离分解尿素的细菌，你能自己动手设计从土壤中分
6、离分解纤维素微手设计从土壤中分离分解纤维素微生物的方法吗？生物的方法吗？想一想想一想从土壤中分离分解维生素的微生物。从土壤中分离分解维生素的微生物。重点与难点重点与难点（二）（二）纤维素分解菌的筛选纤维素分解菌的筛选1、刚果红染色法、刚果红染色法 在含有纤维素的培养基中加入在含有纤维素的培养基中加入刚果红刚果红，在纤维素分解菌周围会产生以菌落为中心在纤维素分解菌周围会产生以菌落为中心透明圈。透明圈。纤维素分解菌的筛选纤维素分解菌的筛选1、筛选纤维素分解菌的方法是、筛选纤维素分解菌的方法是_。该方法可以通过该方法可以通过_反应直接筛选。反应直接筛选。刚果红染色法刚果红染色法颜色颜色2、其原理是：
7、刚果红可以与纤维素形成、其原理是：刚果红可以与纤维素形成_，当纤维素被，当纤维素被_分解后，红色分解后，红色复合物无法形成，出现以复合物无法形成，出现以_为中心的为中心的_，我们可以通过，我们可以通过_来筛选纤来筛选纤维素分解菌。维素分解菌。红色复合物红色复合物纤维素酶纤维素酶纤维素分解菌纤维素分解菌 透明圈透明圈是否产生透明圈是否产生透明圈二、实验设计二、实验设计将样品涂布到鉴别纤维素分解将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上菌的培养基上土壤取样土壤取样选择培养选择培养梯度稀释梯度稀释分离分解纤维素微生物实验流程示意图分离分解纤维素微生物实验流程示意图挑选产生透明挑选产生透明圈的菌落圈的菌落
8、具体操作步骤：具体操作步骤：1、土样采集、土样采集 方法与课题方法与课题2类似。土样采集要在富含类似。土样采集要在富含纤维素的环境中进行，如果找不到适合的环纤维素的环境中进行，如果找不到适合的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。也会有能分解纤维素的微生物生长。思考思考 为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？素分解菌？答：由于生物与环境的相互依存关系，答：由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高。量相对提
9、高。思考思考 将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？纸应该埋进土壤多深？答：将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相答：将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。适宜环境。一般应将纸埋于深约一般应将纸埋于深约10cm的腐殖土壤中。的腐殖土壤中。2、选择培养、选择培养 称取土样称取土样20g，在无菌条件下加入装有，在无菌条件下加入装有30mL培养基的摇瓶中。培养基的摇瓶中。30震荡培养震荡培养1-2天，天，至培养基变浑浊。进行梯度稀释和涂布平至培养基变浑浊。进行梯
10、度稀释和涂布平板。板。纤维素粉纤维素粉5.0gNaNO31.0gKH2PO40.9gNa2HPO47H2O1.2gMgSO47H200.5gKCl0.5g水解酪素水解酪素0.5g酵母膏酵母膏0.5g蒸馏水蒸馏水1000mL纤维素分解菌的选择培养基配方纤维素分解菌的选择培养基配方1 1、纤维素分解菌选择培养基属于、纤维素分解菌选择培养基属于_（固体、液体）（固体、液体）培养基，原因是培养基，原因是_。【资料二资料二】选择培养选择培养阅读资料二阅读资料二“选择培养基选择培养基”，回答以下几个问题：，回答以下几个问题：液体液体没有添加琼脂成分没有添加琼脂成分2、该培养基对微生物、该培养基对微生物_（
11、具有，不具有）选择作用。（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是如果具有，其选择机制是_。以纤维素粉为唯一碳源，能分解纤维素的微生物可以以纤维素粉为唯一碳源，能分解纤维素的微生物可以大量繁殖大量繁殖 具有具有 想想一一想想 为什么选择培养能够为什么选择培养能够“浓缩浓缩”所需的微生物？所需的微生物？答：在选择培养条件下，答：在选择培养条件下，使那些能够适应条件的微生物使那些能够适应条件的微生物得到迅速繁殖，而不适应这种得到迅速繁殖，而不适应这种的微生物被抑制。的微生物被抑制。若设置一个对照实验说明选择培若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是将养的作用，应控制的变量是将_改
12、为改为_。你能否设计一个对照实验，说明选择培你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？养基的作用？葡萄糖葡萄糖纤维素粉纤维素粉鉴别纤维素分解菌的培养基配方鉴别纤维素分解菌的培养基配方CMC-Na5-10gKH2PO40.25g琼脂琼脂15g土豆汁土豆汁100mL酵母膏酵母膏0.5g蒸馏水蒸馏水1000mL方法一：方法一：先培养微生物，再加入刚果先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应。红进行颜色反应。优点：显示出的透明圈基本上是纤维素优点：显示出的透明圈基本上是纤维素分解菌的作用。分解菌的作用。缺点：加入刚果红溶液时菌落之间发生混缺点：加入刚果红溶液时菌落之间发生混杂。杂。方法一中方法一中N
13、aCl溶液的作用？溶液的作用？思考：思考：漂洗作用漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。方法二：方法二：在倒平板时加入刚果红。在倒平板时加入刚果红。优点：操作简便，不存在菌落混杂问题。优点：操作简便，不存在菌落混杂问题。缺点缺点1：在纤维素粉和琼脂、土豆汁中都：在纤维素粉和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物周围出现透明圈。的微生物周围出现透明圈。缺点缺点2：有些微生物具有降解色素的能力，：有些微生物具有降解色素的能力，在长时间培养过程中会降解刚果红
14、而形成在长时间培养过程中会降解刚果红而形成明显的透明圈。明显的透明圈。三、操作提示三、操作提示1、复习微生物技术、复习微生物技术a培养基的配制培养基的配制b无菌操作技术无菌操作技术c稀释涂布平板法稀释涂布平板法d选择培养基的作用选择培养基的作用e土壤取样土壤取样讨论讨论 本实验的流程与分离土壤中分解尿素本实验的流程与分离土壤中分解尿素的细菌的实验流程有哪些异同？的细菌的实验流程有哪些异同？答：课题答：课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的在以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基上，直接分离上，直接分离得到菌落。得到菌落。本实验通过本实验通过选择培养基
15、选择培养基，使纤维素分解菌得，使纤维素分解菌得到繁殖后，再将菌液涂布在到繁殖后，再将菌液涂布在鉴别培养基鉴别培养基上。其他上。其他步骤基本一致。步骤基本一致。四、结果分析与评价四、结果分析与评价2、培养基的制作是否合格以及、培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落？选择培养基是否筛选出菌落？u 对照的培养基在培养过程中没有菌落。对照的培养基在培养过程中没有菌落。u 观察到产生透明圈的菌落。观察到产生透明圈的菌落。3、分离的结果是否一致？、分离的结果是否一致？u 由于在土壤中细菌的数量远高于真菌和由于在土壤中细菌的数量远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是放线菌的数量，因此最容
16、易分离得到的是细菌。细菌。u 由于所取土样的环境不同，可能得到真由于所取土样的环境不同，可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。菌和放线菌等不同的分离结果。五、课题延伸五、课题延伸纤维素酶发酵方法纤维素酶发酵方法:液体发酵液体发酵固体发酵固体发酵纤维素酶测定方法纤维素酶测定方法:对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定生的葡萄糖进行定量测定2 答：流程图如下。答：流程图如下。土壤取样土壤取样选择培养（此步是否需要，应根选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量得多少来确定）据样品中目的菌株数量得多少来确定）梯梯度稀释度稀释将菌悬液涂布到有特定选择作用的将菌悬液涂布到有特定选择作用的培养基上培养基上挑选单菌落挑选单菌落发酵培养发酵培养习题答案习题答案基础基础知识知识实验设计实验设计纤维素纤维素组成组成纤维素酶纤维素酶操作提示操作提示复习微生物技术复习微生物技术分布分布组成组成作用作用刚果红法刚果红法作用作用实验流程图实验流程图纤维素酶测定方法纤维素酶测定方法选择培养的操作方法选择培养的操作方法分解分解纤维纤维素的素的微生微生物的物的分离分离 纤维素分解纤维素分解菌的筛选菌的筛选纤维素酶发酵方法纤维素酶发酵方法具体操作步骤具体操作步骤原理原理结果分析与评价结果分析与评价课题延伸课题延伸课堂小结课堂小结