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1、TUNEL 法检测细胞凋亡实验原理和方法细胞凋亡中染色体 DNA 的断裂是个渐进的分阶段的过程,染色体 DNA 首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为 50-300kb 的大片段。然后大约 30 的染色体 DNA 在 Ca 和 Mg 依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成 180200bp 核小体 DNA 多聚体.DNA 双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列 DNA 的 3-OH 末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到 DNA 的 3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般
2、称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 的断裂，因而没有 3-OH 形成,很少能够被染色。低分子量的 DNA 分离后，也可使用 DNA 聚合酶进行缺口翻译（nick translation),使低分子量的 DNA 标记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNEL 或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般
3、的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。一、过氧化物酶标记测定法一、过氧化物酶标记测定法原理：原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛（digoxigenin)-11dUTP在 TdT 酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链 DNA 的 3OH 末端，与 dATP形成异多聚体,并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应,特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察.毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体,因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异
4、性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到 1,若此抗体的 Fc 部分通过蛋白酶水解的方法除去后，则可完全排除细胞 Fc 受体非特异性的吸附作用。本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定。(一）试剂配制一）试剂配制1、磷酸缓冲液 PBS(pH7.4)：磷酸钠盐 50mM,NaCl 200mM。2、蛋白酶 K(200g/ml，pH7。4）：蛋白酶 K 0.02g；PBS 100ml。3、含 2H2O2 的 PBS 缓冲液（pH7.4):H2O2 2.0ml；PBS 缓冲液 98.0ml。4、TdT 酶缓冲液（新鲜配）：Trlzma 碱 3。63g
5、用 0。1N HCl 调节 pH 至 7.2,加 ddH2O 定容到 1000ml;再加入二甲砷酸钠 2996g 和氯化钴 0.238g.5、TdT 酶反应液：TdT 酶 32l；TdT 酶缓冲液 76l，混匀,置于冰上备用.6、洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠 17.4g；柠檬酸钠 8.82g；ddH2O 1000ml7、0.05%二氨基联苯（DAB）溶液:DAB 5mg;PBS 10ml，pH7。4,临用前过滤后，加过氧化氢至 0。02%。8、0。5甲基绿(pH4.0）：甲基绿 0。5g；0。1M 乙酸钠 100ml.9、100丁醇，100、95、90、80和 70%乙醇，二甲苯，10中性甲醛
6、溶液，乙酸，松香水等。10、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体（ONCOR）（二（二)实验步骤实验步骤1、标本预处理：（1)石蜡包埋的组织切片预处理:将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次 5min.用无水乙醇洗两次，每次 3min.用 95和 75乙醇各洗一次,每次3min。用 PBS 洗 5min 加入蛋白酶 K 溶液（20ugml），于室温水解 15min，去除组织蛋白。用蒸馏水洗 4 次，每次 2min，然后按下述步骤 2 进行操作.（2)冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10中性甲醛中，于室温固定10min 后，去除多余液体。用 PBS 洗两次，每次 5min。置乙醇：乙酸（2：1
7、）的溶液中,于20处理 5min，去除多余液体。用PBS 洗两次，每次 5min，然后按下述步骤 2 进行操作。（3）培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约 5 107 个/ml 细胞于 4中性甲醛室温中固定 10min。在载玻片上滴加 50100l 细胞悬液并使之干燥.用PBS 洗两次，每次 5min，然后按下述步骤 2 进行操作。2、色缸中加入含2过氧化氢的 PBS,于室温反应 5min。用PBS 洗两次，每次5min。3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加 2 滴 TdT 酶缓冲液,置室温 15min。4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加 54l
8、TdT 酶反应液,置湿盒中于 37C 反应 1hr（注意：阴性染色对照,加不含 TdT 酶的反应液）。5、将切片置于染色缸中，加入已预热到 37的洗涤与终止反应缓冲液,于 37保温 30min,每 10min 将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。6、组织切片用 PBS 洗 3 次，每次 5min 后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体,于湿盒中室温反应 30min.7、用 PBS 洗 4 次，每次 5min.8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的 0.05DAB 溶液，室温显色 36min。9、用蒸馏水洗 4 次，前 3 次每次 1min，最后 1 次 5min.10、于室温用甲基绿进行复染 10min.用蒸馏水洗 3 次，前两次将载玻片提起放下 10 次，最后 1 次静置 30s。依同样方法再用 100正丁醇洗三次。11、用二甲苯脱水 3 次,每次 2min,封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。（三）注意事项一定要设立阳性和阴性细胞对照。阳性对照的切片可使用 DNaseI 部分降解的标本，阳性细胞对照可使用地塞米松(1M)处理 34hr 的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞。阴性对照不加 TdT 酶，其余步骤与实验组相同。