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1、仪器分析课程讲义仪器分析课程讲义第四节第四节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪1目录目录高效液相色谱仪高效液相色谱仪 高效液相色谱的固定相和流动相高效液相色谱的固定相和流动相23输液系统输液系统进样系统进样系统分离系统分离系统检测系统检测系统数据处理系统数据处理系统6.2 高效液相色谱高效液相色谱仪仪4 5一、输液系统一、输液系统1 1贮液器贮液器贮贮液液罐罐的的材材料料应应耐耐腐腐蚀蚀，对对溶溶剂剂呈呈惰惰性性，容积约为容积约为0 052520 0L L；贮液罐放置要高于泵体；贮液罐放置要高于泵体；使用过程贮液罐应密闭；使用过程贮液罐应密闭；溶溶剂剂在在放放入入贮贮液液罐罐之之前前必必须须经经过
2、过0 04545umum滤膜过滤。滤膜过滤。62 2脱气装置脱气装置作用作用：脱去流动相中的溶解气体。：脱去流动相中的溶解气体。(1)(1)吹氮脱气法吹氮脱气法 (2)(2)加热回流法加热回流法 (3)(3)抽真空脱气法抽真空脱气法 (4)(4)超声波脱气法超声波脱气法(5)(5)在线真空脱气法在线真空脱气法(on1ine degasser)on1ine degasser)73 3、高压输液泵高压输液泵 输送流动相输送流动相压力压力：150350105 Pa 作用作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到：将流动相以稳定的流速或压力输送到 色谱系统。色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结果输液泵
3、的稳定性直接关系到分析结果 的重复性和准确性。的重复性和准确性。8高压泵按其性质可分为高压泵按其性质可分为恒压泵恒压泵、恒流泵恒流泵两类两类1）往复式柱塞泵）往复式柱塞泵：恒流恒流泵泵；易于更换溶剂，适用于梯易于更换溶剂，适用于梯度洗脱但有脉冲波动，可度洗脱但有脉冲波动，可以加一阻尼器抑制脉冲。以加一阻尼器抑制脉冲。92）气动放大泵：）气动放大泵：恒压泵恒压泵液缸体积大，更换流动相液缸体积大，更换流动相不方便，不便于梯度洗脱，不方便，不便于梯度洗脱，无脉冲、稳定流量的输出无脉冲、稳定流量的输出,现多用于装柱。现多用于装柱。10b.高压定量进样阀：高压定量进样阀：高压定量进样阀：高压定量进样阀：
4、（六（六（六（六通阀进样装置）通阀进样装置）通阀进样装置）通阀进样装置）c.优点：进样准确，重优点：进样准确，重优点：进样准确，重优点：进样准确，重现性好，适于定量分析现性好，适于定量分析现性好，适于定量分析现性好，适于定量分析d.c.c.自动进样器：自动进样器：自动进样器：自动进样器：计算机控计算机控计算机控计算机控制，适合大量进样。制，适合大量进样。制，适合大量进样。制，适合大量进样。二、进样装置二、进样装置a.停留进样装置：停留进样装置：b.缺点：不能承受高压，须停流进样；缺点：不能承受高压，须停流进样；无法取得精确的保留时间无法取得精确的保留时间11三、高效分离柱三、高效分离柱 色谱柱
5、是实现分离的核心部件。色谱柱是实现分离的核心部件。发展趋发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。12 常规液相色谱柱常规液相色谱柱 16 mm，1050 cm。微孔填充柱微孔填充柱 0.5-1mm 毛毛细细管柱管柱 30-50m装柱方法：有干法和湿法，按粒度装柱方法：有干法和湿法，按粒度20m划分。划分。13柱温控制柱温控制下列几种情况需要控制柱温：下列几种情况需要控制柱温：n法定标准分析方法中，要求保留时间具法定标准分析方法中，要求保留时间具有再现性；有再现性；n必须通过改变柱温来提高分离效率；必须通过改变柱温来提高分离效率；n对高分子化合物或黏度大的样品；
6、对高分子化合物或黏度大的样品；n对一些具有生物活性的生物分子；对一些具有生物活性的生物分子；n对一些组成复杂的样品，使用二维色谱对一些组成复杂的样品，使用二维色谱技术。技术。14四、液相色谱检测器四、液相色谱检测器1.紫外检测器紫外检测器:应用最广，对大部分有机化合应用最广，对大部分有机化合物有响应。物有响应。作用原理：作用原理：被分析试样组分对特定波长紫外被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵守比尔定律。系遵守比尔定律。15特点：特点：灵敏度高，可达灵敏度高，可达10-9g.mL-1；线性范围高；线性范围高；可用梯度洗脱；可用
7、梯度洗脱；对流动相的流速和温度变化不敏感；对流动相的流速和温度变化不敏感；不适用于对紫外不吸收的试样；不适用于对紫外不吸收的试样；紫外光不透过的溶剂不能用（苯等）。紫外光不透过的溶剂不能用（苯等）。162.2.光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器紫外可见光度检测紫外可见光度检测紫外可见光度检测紫外可见光度检测器的重要进展；器的重要进展；器的重要进展；器的重要进展；10211021个二极管阵列，个二极管阵列，个二极管阵列，个二极管阵列，各检测某一特定波各检测某一特定波各检测某一特定波各检测某一特定波长，无需停流扫描长，无需停流扫描长，无需停流扫描长，无需停流扫描而观察色谱柱流出而观察色谱柱流
8、出而观察色谱柱流出而观察色谱柱流出物的各个瞬间的动物的各个瞬间的动物的各个瞬间的动物的各个瞬间的动态光谱吸收图态光谱吸收图态光谱吸收图态光谱吸收图17 光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器183.3.差示折光检测器（差示折光检测器（differential refractive index detector）除紫外检测器之外应用最多的检测器；除紫外检测器之外应用最多的检测器；可可连连续续检检测测参参比比池池和和样样品品池池中中溶溶液液的的折折光光指数差值。差值与浓度呈正比；指数差值。差值与浓度呈正比；19特点：特点：通用型检测器通用型检测器;灵敏度低
9、（灵敏度低（10-7g.mL-1），不能用于痕量分，不能用于痕量分析析;对温度敏感，要求使用温度恒定对温度敏感，要求使用温度恒定;对流动相流量变化敏感，不能用于梯度洗脱。对流动相流量变化敏感，不能用于梯度洗脱。2021许多有机化合物，特别是芳许多有机化合物，特别是芳香族化合物、香族化合物、受紫外光激发受紫外光激发后能够辐射出荧光。后能够辐射出荧光。4.荧光检测器（荧光检测器（fluorescence detector）22高灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度(比紫外检测器高两个数量级，达比紫外检测器高两个数量级，达比紫外检测器高两个数量级，达比紫外检测器高两个数量级，达1010-11-11g.ml
10、g.ml-1-1)高选择性高选择性高选择性高选择性;线性范围窄；线性范围窄；线性范围窄；线性范围窄；测量中不能使用抑制、吸收荧光的溶剂；测量中不能使用抑制、吸收荧光的溶剂；测量中不能使用抑制、吸收荧光的溶剂；测量中不能使用抑制、吸收荧光的溶剂；对不产生荧光的物质，可使其转变成荧光对不产生荧光的物质，可使其转变成荧光对不产生荧光的物质，可使其转变成荧光对不产生荧光的物质，可使其转变成荧光物质；物质；物质；物质；广泛应用于生物化工、制药、食品和环境广泛应用于生物化工、制药、食品和环境广泛应用于生物化工、制药、食品和环境广泛应用于生物化工、制药、食品和环境监测中监测中监测中监测中.235.电导检测器
11、（电导检测器（electrical conductivity detector）属属电化学检测器电化学检测器，是离子色谱法中应用最，是离子色谱法中应用最为广泛的检测器为广泛的检测器作用原理作用原理：根据物质在某些介质中电离后：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导变化来测定电离物质的含所产生的电导变化来测定电离物质的含量。量。24五、五、液相色谱法固定相液相色谱法固定相1.1.固定相的形状固定相的形状（1）全多孔型）全多孔型 最初由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多最初由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体孔球体 100m的大颗粒，表面涂渍固定液。的大颗粒，表面涂渍固定液。传质速度慢，柱效低。
12、传质速度慢，柱效低。现采用现采用10m以下的小颗粒以下的小颗粒。25（2）表面多孔型）表面多孔型(薄壳型微珠薄壳型微珠)3040m的玻璃微球，表面附着一的玻璃微球，表面附着一层厚度为层厚度为1 2m的多孔硅胶。的多孔硅胶。表面积小，传质速度快，但柱容量低；表面积小，传质速度快，但柱容量低；262.液液-固吸附固定相固吸附固定相极性：硅胶、氧化镁、分子筛极性：硅胶、氧化镁、分子筛 等；等；非极型：高聚物微球、石墨化碳黑、聚合非极型：高聚物微球、石墨化碳黑、聚合物包裹固定相。物包裹固定相。结构类型：全多孔型和薄壳型；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：粒度：510 m；273.3.液液-液色谱固定相
13、液色谱固定相n惰性载体惰性载体：硅胶，无机氧化物、高分子硅胶，无机氧化物、高分子聚合物、脲醛树脂等，多为聚合物、脲醛树脂等，多为310um310um的全的全多孔微球多孔微球。n固定液固定液：正相：正相：氰基柱、胺基柱等氰基柱、胺基柱等 反相反相 :烷基柱、苯基柱。烷基柱、苯基柱。284.化学键合固定相化学键合固定相化学键合固定相化学键合固定相化学键合固定相化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定目前应用最广、性能最佳的固定目前应用最广、性能最佳的固定目前应用最广、性能最佳的固定相，一般用硅胶作为基体。相，一般用硅胶作为基体。相，一般用硅胶作为基体。相，一般用硅胶作为基体。a.a.硅氧碳键型
14、：硅氧碳键型：硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiSiOOC C b.b.硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiSiOOSi Si C C c.c.硅碳键型：硅碳键型：硅碳键型：硅碳键型：SiSiC C d.d.硅氮键型：硅氮键型：硅氮键型：硅氮键型：SiSiN N29化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点（1）传质快）传质快，表面无深凹陷，表面无深凹陷;（2）寿命长寿命长，无固定液流失，耐流动相冲无固定液流失，耐流动相冲击；击；（3）选择性好）选择性好，可键合不同官能团，可键合不同官能团；（4）有利于梯度洗脱；）有利于梯度洗脱；30六、六、液相色谱法流动相液相色谱法流动相1.
15、1.流动相特性流动相特性2.2.（1 1）流动相的种类、配比可显著改变组）流动相的种类、配比可显著改变组分分离状况；分分离状况；3.3.（2 2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，）亲水性固定液常采用疏水性流动相，称为正相液液色谱法称为正相液液色谱法;4.4.（3 3）流动相的极性大于固定液的极性，）流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱则称为反相液液色谱 。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。312.流动相类别流动相类别按流动相组成分按流动相组成分：单组分和多组分；单组分和多组分；按极性分按极性分：极性、弱极性、非极性；极性、弱极性、非极性；按
16、使用方式分按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗固定组成淋洗和梯度淋洗 32常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：水、酰胺、腈、醇、酮、水、酰胺、腈、醇、酮、酯、醚、烃类酯、醚、烃类,etc.etc.流动相可分为：流动相可分为：底剂底剂及及洗脱剂洗脱剂 底剂：底剂：决定基本的色谱分离情况；决定基本的色谱分离情况；洗脱剂：洗脱剂：调节试样组分的滞留并对几个组分具调节试样组分的滞留并对几个组分具有选择性的分离作用。有选择性的分离作用。3.3.流动相的选择流动相的选择采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整
17、出峰时间。相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。33正相液正相液-液分配分离（液固色谱极性固定相）液分配分离（液固色谱极性固定相）：底剂：低极性的溶剂，如正己烷、苯、氯仿等，底剂：低极性的溶剂，如正己烷、苯、氯仿等，洗脱剂：根据试样的性质选取中等极性溶剂如醚、洗脱剂：根据试样的性质选取中等极性溶剂如醚、酮、醇等。酮、醇等。反相色谱（液固色谱非极性固定相）反相色谱（液固色谱非极性固定相）：底剂：底剂：水。水。洗脱剂：洗脱剂：有机溶剂作为极性调节剂有机溶剂作为极性调节剂。344 梯度洗脱梯度洗脱n n 梯度洗脱梯度洗脱，与气相色谱中的，与气相色谱中的程序升温程序升温一样，一样，可极大地改
18、善分离效果可极大地改善分离效果n n 在分离过程中按照一定的程序连续改变载在分离过程中按照一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素。变化来改变被分离组分的分离因素。35 通过梯度洗脱，可缩短分离时间、通过梯度洗脱，可缩短分离时间、提高分辨能力、改善峰形，还可提高分辨能力、改善峰形，还可提高分析精度。提高分析精度。36n溶剂的组成在溶剂的组成在1515minmin内，从内，从1010（V/VV/V）CHCH3 3CN-HCN-H2 2O O随时间改变至随时间改变至5050CHCH3 3CN-HCN-H2 2O
19、O 37梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度外梯度:两台高压泵，两台高压泵，两台高压泵，两台高压泵，将两种不同极性的溶剂将两种不同极性的溶剂将两种不同极性的溶剂将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度按一定的比例送入梯度按一定的比例送入梯度按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色混合室，混合后进入色混合室，混合后进入色混合室，混合后进入色谱柱。谱柱。谱柱。谱柱。内梯度内梯度:一台高压泵一台高压泵一台高压泵一台高压泵,通过比例调节阀通过比例调节阀通过比例调节阀通过比例调节阀,将两将两将两将两种或多种不同极性的溶种或多种不同极性的溶种或多种不同极性的溶种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高剂按一定的比
20、例抽入高剂按一定的比例抽入高剂按一定的比例抽入高压泵中混合。压泵中混合。压泵中混合。压泵中混合。38讨论1 用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品，以某一比例甲醇-水为流动相时，样品容量因子较小，若想使容量因子增加，较好的办法是nA 增加流动相中甲醇的比例nB增加流动相中水的比例nC流动相中加入少量HAcnD流动相中加入少量的氨水39讨论2n在反相色谱法中，若以甲醇-水为流动相，增加甲醇的比例时，组分的容量因子k与保留时间tR如何变化？40作业1.在在ODS柱上，以甲醇为流动相，某组分的分配柱上，以甲醇为流动相，某组分的分配容量容量k=1.2,如以乙腈为流动相，其如以乙腈为流动相，其k值是增加值是
21、增加还是减少，为什么？还是减少，为什么？2.在硅胶柱上，用甲苯为流动相，某组分的保留在硅胶柱上，用甲苯为流动相，某组分的保留时间是时间是30min，如果改用四氯化碳或乙醚为流，如果改用四氯化碳或乙醚为流动相，试分析该组分的保留时间如何变化？动相，试分析该组分的保留时间如何变化？3.3.在液相色谱法中，梯度淋洗适用于分离何种在液相色谱法中，梯度淋洗适用于分离何种在液相色谱法中，梯度淋洗适用于分离何种在液相色谱法中，梯度淋洗适用于分离何种试样？试样？试样？试样？41人干扰素人干扰素人干扰素人干扰素-等电点等电点等电点等电点8.58.5底剂：底剂：底剂：底剂：5050mmol/L mmol/L 磷酸
22、盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，pH8.0pH8.0洗脱剂：洗脱剂：洗脱剂：洗脱剂：5050mmol/L mmol/L 磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，pH8.5pH8.5，1mol/L NaCl1mol/L NaCl2 2）离子交换色谱流动相）离子交换色谱流动相）离子交换色谱流动相）离子交换色谱流动相组分保留值可通过流动相中组分保留值可通过流动相中组分保留值可通过流动相中组分保留值可通过流动相中盐浓度盐浓度盐浓度盐浓度及及及及pHpHpHpH来调节来调节来调节来调节 42七、高效液相色谱的应用七、高效液相色谱的应用 1.1.环境中有机氯农药残留量分
23、析环境中有机氯农药残留量分析固定相固定相固定相固定相：薄壳型硅胶薄壳型硅胶薄壳型硅胶薄壳型硅胶(37(37 5050 m)m)流动相：正己烷流动相：正己烷流动相：正己烷流动相：正己烷 流流流流 速：速：速：速：1.5 1.5 mL/minmL/min 色谱柱：色谱柱：色谱柱：色谱柱：5050cmcm 2.5mm(2.5mm(内径内径内径内径)检测器：差示折光检测器检测器：差示折光检测器检测器：差示折光检测器检测器：差示折光检测器可对水果、蔬菜中的农药残留量进可对水果、蔬菜中的农药残留量进可对水果、蔬菜中的农药残留量进可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。行分析。行分析。行分析。432.2.稠环
24、芳烃的分析稠环芳烃的分析稠环芳烃多为致癌物质稠环芳烃多为致癌物质稠环芳烃多为致癌物质稠环芳烃多为致癌物质反相液反相液反相液反相液-液色谱法液色谱法液色谱法液色谱法固定相固定相固定相固定相：十八烷基硅烷化键合相十八烷基硅烷化键合相十八烷基硅烷化键合相十八烷基硅烷化键合相 流动相：流动相：流动相：流动相：20%20%甲醇甲醇甲醇甲醇-水水水水 100%100%甲醇甲醇甲醇甲醇 线性梯度淋洗，线性梯度淋洗，线性梯度淋洗，线性梯度淋洗，2%/2%/minmin 流流流流 速：速：速：速：1 1mL/minmL/min 柱柱柱柱 温：温：温：温：5050 C C 柱柱柱柱 压：压：压：压：70 70 10104 4 PaPa 检测器：紫外检测器检测器：紫外检测器检测器：紫外检测器检测器：紫外检测器44正相和反相色谱的区别比比较项目目正相色正相色谱反相色反相色谱固定相固定相极性极性非（弱）极性非（弱）极性流流动相相非（弱）极性非（弱）极性极性极性流出次序流出次序极性极性组分分k大大极性极性组分分k 小小流流动相极性的影相极性的影响响极性增加，极性增加，k减减小小极性增加，极性增加，k增增大大45个人观点供参考，欢迎讨论！