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1、常用检测方法的分析第1页，本讲稿共21页HPV检测的意义HPV 感染与CIN 和宫颈癌变有着密切的关系HPV的检测可能对宫颈癌的预后有预测作用HPV检测对科学研究的价值第2页，本讲稿共21页常用检测方法1细胞学检查；2.组织学检查；3感染组织中HPV蛋白的检测；4.HPV感染的血清学检查；5.HPV基因组检测.第3页，本讲稿共21页细胞学检查 传统巴氏涂片（传统巴氏涂片（CV）液基薄层细胞学技术液基薄层细胞学技术(TCT)自动细胞学检测系统自动细胞学检测系统test，又称，又称LCT计算机辅助细胞检测系统（计算机辅助细胞检测系统（CCT），），第4页，本讲稿共21页优点与问题 优点：操作简单，
2、价格低廉，适宜作初步筛查；缺点：凹空细胞是HPV 感染的主要形态学改变，但由于其他病毒感染及人为因素均有可能造成细胞内出现空泡或凹空样变，而且细胞学检查易受取材、染色及细胞病理医生的主观判断等因素的影响，因此应用细胞病理学检测HPV 存在灵敏度低、特异性差、假阴性率和假阳性率高、不能对HPV 进行分型.第5页，本讲稿共21页组织学检查；肉眼观察；阴道镜观察；组织检查；第6页，本讲稿共21页优点与问题优点：操作简单，价格低廉，适宜作初步筛查；缺点：准确率低，人员素质要求高，病人痛苦程度大。第7页，本讲稿共21页感染组织中HPV蛋白的检测针对HPV抗原，主要是衣壳蛋白制备抗体，通过免疫学方法进行检
3、测。ELISA，免疫沉淀法等。第8页，本讲稿共21页优点与问题优点：原理明确，操作相对简单缺点：由于HPV 至今尚不能在体外培养，且其免疫原性较弱，故血清学方法检测灵敏度较低。第9页，本讲稿共21页HPV感染的血清学检查检测人体血清中是否存在有针对HPV产生的抗体，通过免疫学方法进行检测。第10页，本讲稿共21页优点与问题优点：原理明确，操作相对简单缺点：血清学检测的对象是抗原和抗体，由于人体对HPV产生免疫应答有一定的迟滞性，所以血清学检测对无免疫应答者和HPV 潜伏期感染者会产生漏检。第11页，本讲稿共21页HPV基因组检测PCR类检测方法Southern杂交法原位杂交杂交捕获法第12页，
4、本讲稿共21页PCR类检测方法优点：该方法灵敏度高，缺点：是容易发生样品间的交叉污染，从而导致假阳性率高。另外利用该方法进行HPV分型操作比较烦琐。第13页，本讲稿共21页Southern杂交法优点：该方法灵敏度及特异性均高，适用于HPV 分型、HPV-DNA分子质量鉴定、基因组酶切图谱建立及物理状态研究等。缺点：其操作麻烦、耗时、费用高，且必须应用新鲜组织标本，故不宜大规模临床使用。第14页，本讲稿共21页原位杂交该法利用HPV 探针与组织中的HPV-DNA 杂交，首先将探针和组织中的双链HPV-DNA 变性为单链，然后使探针与组织杂交.优点：利于病理学分析缺点：杂交链的稳定性不高，在杂交过
5、 程中，部分探针单链复性，使杂交率降低，影响HPV-DNA 的检出率。第15页，本讲稿共21页杂交捕获法 杂交捕获(hybridcapturesystem，HCS)实验是美国Digene 公司新发展的一种检测HPV DNA 的技术，其原理是利用对抗体捕获信号的放大和化学发光信号的检测。基本实验步骤如下：1.样本DNA 双链被释放并分解为核苷酸单链;2.DNA 单链与RNA 探针结合为RNADNA 杂交体;3.特异性抗体将RNADNA 杂交体固定在试管壁或微孔壁上;4.结合有碱性磷酸酶的多个第二抗体与RNADNA 杂交体结合,使信号放大;5.碱性磷酸酶使酶底物发光,判读光的强弱可确定碱性磷酸酶的
6、含量,从而确定RNADNA 杂交体的含量。第16页，本讲稿共21页杂交捕获一代（HC-)试验可检测9 种高危型HPV,包括16、18、31、33、35、45、51、52 和56。所用的反应载体是试管；杂交捕获二代试验(HC)原来的试管法改为96 孔平板法，能同时检测13 种高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59 和68)。第17页，本讲稿共21页第18页，本讲稿共21页优点：其灵敏度和特异性均较好，缺点：存在交叉污染、费用昂贵等问题利用该法进行HPV 分型需要将HPV 常见基因型逐个筛选才能最后确定感染的HPV 型别，成本高。第19页，本讲稿共21
7、页HPV基因芯片检测方法敏感性高、特异性强、检测结果准确可靠。有研究报道，HPV 基因芯片的检测灵敏度是PCR方 法的100 倍。操作简单：通过1次杂交检测不仅可以判断待检样品中是否存在HPV 感染，而且可以鉴定出是哪种型别的HPV 感染。针对性强：对样品中的HPV-DNA 直接进行检测，可以检出HPV 的潜伏期感染，克服了血清学及免疫组化检测法对潜伏感染会产生漏检的缺点，从而实现对疾病的早期快速诊断。同时检测多种HPV 型别，对多重HPV.感染的判断一目了然，克服了其他HPV.检测方法难以判断混合感染或操作烦琐的缺点。第20页，本讲稿共21页问题成本高，芯片制作和使用需要较多昂贵的仪器，如用于原位合成寡核苷酸的光刻机器和合成仪，用于合成后点样的全自动点样仪，用于信号检测的激光共聚焦扫描仪或荧光显微镜等设备，这些都成为基因芯片检测成本居高不下的重要原因，这也是制约基因芯片技术发展及应用的最主要的因素。现阶段芯片检测的灵敏度决定了需要首先扩增模板。一般采用PCR法进行这一步骤，不可避免地带来PCR所具有的局限。核酸杂交反应的特异性尚需提高。第21页，本讲稿共21页