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1、分子诊断临床应用进展上海市临床检验中心主要内容分子诊断概念的演变分子诊断技术的分类基于杂交基础的分子诊断技术及其应用基于扩增基础的分子诊断技术及其应用基于测序基础的分子诊断技术及其应用分子诊断应用前景展望 多聚酶链式反应（PCR：Polymerase Chain Reaction)Polymerase:DNA聚合酶 “链式反应”改变世界核裂变链式反应核裂变链式反应核裂变链式反应核裂变链式反应分子诊断概念的变化分子诊断：应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化分子诊断：应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术，称为分子诊断。分子诊断是预测诊
2、断的主要方法，既可以进而做出诊断的技术，称为分子诊断。分子诊断是预测诊断的主要方法，既可以进行个体遗传病的诊断，也可以进行产前诊断。分子诊断的材料包括行个体遗传病的诊断，也可以进行产前诊断。分子诊断的材料包括DNADNA、RNARNA和和蛋白质。蛋白质。基因诊断：又称基因诊断：又称DNADNA诊断或分子诊断，通过分子生物学和诊断或分子诊断，通过分子生物学和分子遗传学分子遗传学的技术，直的技术，直接检测出分子结构水平和表达水平是否异常，从而对疾病做出判断。接检测出分子结构水平和表达水平是否异常，从而对疾病做出判断。分子生物学：分子生物学：从分子水平上研究生命现象物质基础的学科。研究细胞成分的物理
3、、从分子水平上研究生命现象物质基础的学科。研究细胞成分的物理、化学的性质和变化以及这些性质和变化与生命现象的关系，如遗传信息的传递，化学的性质和变化以及这些性质和变化与生命现象的关系，如遗传信息的传递，基因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能，以及细胞信基因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能，以及细胞信号的转导等。号的转导等。分子诊断技术的分类根据目的基因是否被放大分类根据目的基因是否被放大分类可分为杂交法和扩增法根据被测基因的核酸类型分类根据被测基因的核酸类型分类Southern印迹用于检测DNA；Northern印迹用于检测RNA；斑点印迹或称斑点杂交
4、，既可检测DNA也可检测RNA。根据诊断目的或要求根据诊断目的或要求分为定性诊断、定量诊断和半定量诊断，以及序列分析等根据分子之间的作用形式杂交、扩增、测序基于分子杂交为基础的分子诊断技术发展及其应用基于分子杂交为基础的分子诊断技术发展及其应用基于分子杂交为基础的分子诊断技术发展及其应用基于分子杂交为基础的分子诊断技术发展及其应用基于分子杂交的分子诊断技术及其应用两条同源核酸分子（两条同源核酸分子（DNADNA或或RNARNA）可以在碱基互补的原则下形成异质双链是遗传）可以在碱基互补的原则下形成异质双链是遗传物质最重要的化学特征，这一过程亦被称为分子杂交（物质最重要的化学特征，这一过程亦被称为
5、分子杂交（molecular hybridizationmolecular hybridization）。）。分子杂交是所有分子生物学技术的基础，从最初的印迹杂交（分子杂交是所有分子生物学技术的基础，从最初的印迹杂交（southern Blotsouthern Blot和和northern Blotnorthern Blot）到实时）到实时PCRPCR（real time PCRreal time PCR），从基因芯片再到高通量的），从基因芯片再到高通量的DNADNA测序测序技术，都离不开碱基互补的分子杂交反应。而且在理论上可以特异性相互作用的技术，都离不开碱基互补的分子杂交反应。而且在理论上
6、可以特异性相互作用的两个不同分子，例如核酸与核酸之间（两个不同分子，例如核酸与核酸之间（A-GA-G、G-CG-C）、蛋白与蛋白之间（抗原和抗）、蛋白与蛋白之间（抗原和抗体）甚至核酸和蛋白之间（适体与多肽）的相互作用都可以视为分子杂交的不同体）甚至核酸和蛋白之间（适体与多肽）的相互作用都可以视为分子杂交的不同表现模式。表现模式。因此，广义的分子杂交技术是指以核酸、蛋白、糖基以及细胞、代谢物等分子的因此，广义的分子杂交技术是指以核酸、蛋白、糖基以及细胞、代谢物等分子的相互作用所建立的分析方法。目前临床应用的以分子杂交技术为基础的诊断技术相互作用所建立的分析方法。目前临床应用的以分子杂交技术为基础
7、的诊断技术繁多，缺乏统一的分类方法，但是可以根据实验方法的差异分为主要的两种类型，繁多，缺乏统一的分类方法，但是可以根据实验方法的差异分为主要的两种类型，一类是通过特异性的标记探针检测检测细胞内的核酸物质，而另一类是通过探针一类是通过特异性的标记探针检测检测细胞内的核酸物质，而另一类是通过探针检测从细胞内提取的核酸、蛋白等物质，前者以原位杂交及其衍生的技术为主，检测从细胞内提取的核酸、蛋白等物质，前者以原位杂交及其衍生的技术为主，后者以生物芯片及其衍生的技术为主。后者以生物芯片及其衍生的技术为主。荧光原位杂交（FISH）原位杂交应用特异性的探针检测细胞内的核酸需要标记分子显示杂交信号，原位杂交
8、应用特异性的探针检测细胞内的核酸需要标记分子显示杂交信号，1960s1960s年代的检测技术是放射性核素标记，但是信号检测程序复杂并且可能存在放射性年代的检测技术是放射性核素标记，但是信号检测程序复杂并且可能存在放射性物质的污染，而荧光物质标记可以通过显微镜直接观察实验结果，因此荧光标记物质的污染，而荧光物质标记可以通过显微镜直接观察实验结果，因此荧光标记的原位杂交技术（的原位杂交技术（Fluorescent in situ hybridiztionFluorescent in situ hybridiztion，FISHFISH）一经出现立刻取代了放射）一经出现立刻取代了放射性标记的技术，成
9、为应用最广泛的分子杂交技术。性标记的技术，成为应用最广泛的分子杂交技术。FISHFISH技术通过荧光标记探针，技术通过荧光标记探针，可以可视化的检测人类细胞或组织中特定基因的数量及其定位，是分子杂交与细可以可视化的检测人类细胞或组织中特定基因的数量及其定位，是分子杂交与细胞遗传学技术的结合。胞遗传学技术的结合。IFSHIFSH技术的分析过程分为四个步骤，核酸变性、探针变性、杂交及信号检测。因技术的分析过程分为四个步骤，核酸变性、探针变性、杂交及信号检测。因此，针对探针标记、染料开发和图像分析的技术的更新是此，针对探针标记、染料开发和图像分析的技术的更新是FISHFISH分析技术发展的主分析技术
10、发展的主要路径。要路径。荧光原位杂交衍生技术首先是荧光染料的应用，从最初的单色首先是荧光染料的应用，从最初的单色FITCFITC应用，发展到使用多种荧光染料的多应用，发展到使用多种荧光染料的多色色FISHFISH技术，既多元荧光原位杂交和光谱核型分析技术，使用五种染料技术，既多元荧光原位杂交和光谱核型分析技术，使用五种染料（Rhodamine,Texas-red,Cy5,FITC,and Cy5.5Rhodamine,Texas-red,Cy5,FITC,and Cy5.5）标记的探针可以在一次试验中定位）标记的探针可以在一次试验中定位多种不同的基因以及使用不同的颜色标记显示多种不同的基因以及
11、使用不同的颜色标记显示2424条不同的染色体。条不同的染色体。其次，在探针方面，染色体臂、着丝粒、端粒特异的探针被先后开发应用，而且其次，在探针方面，染色体臂、着丝粒、端粒特异的探针被先后开发应用，而且应用微切割技术切割技术制备亚区域探针（应用微切割技术切割技术制备亚区域探针（microFISHmicroFISH），使），使FISHFISH的基因定位和分的基因定位和分辩率大大提高辩率大大提高6 6。同时，探针标记对象和标记技术的发展不断衍生出新的同时，探针标记对象和标记技术的发展不断衍生出新的FISHFISH技术，例如比较基因技术，例如比较基因组杂交、引物原位标记技术、肽核酸探针原位杂交、物种
12、交叉荧光原位杂交、纤组杂交、引物原位标记技术、肽核酸探针原位杂交、物种交叉荧光原位杂交、纤维原位杂交等。维原位杂交等。在图像与信号分析方面，应用高分辨率在图像与信号分析方面，应用高分辨率CCDCCD摄像机和计算机自动图像分析系统获摄像机和计算机自动图像分析系统获得广泛应用，而得广泛应用，而SKYSKY结合傅立叶频谱技术，同时计量可见光和近结合傅立叶频谱技术，同时计量可见光和近红外范围内的所红外范围内的所有点的发射频谱而一次成像。有点的发射频谱而一次成像。荧光原位杂交结果JournalofCellScience2003；116（14）FISH的应用在产前诊断方面，在产前诊断方面，FISHFISH
13、主要用于染色体数目异常的诊断，与常规核型分析的一致主要用于染色体数目异常的诊断，与常规核型分析的一致性可以达到性可以达到99.599.5，但结果报告时间只要，但结果报告时间只要2424小时，大大低于核型分析的平均小时，大大低于核型分析的平均2 2周左周左右的报告时间，右的报告时间，FISHFISH在多数的发达国家已经批准为常规产前筛查辅助诊断技术。在多数的发达国家已经批准为常规产前筛查辅助诊断技术。在血液肿瘤的诊断方面，在血液肿瘤的诊断方面，FISHFISH用于染色体异位的融合基因检测、基因缺失检测、用于染色体异位的融合基因检测、基因缺失检测、微小残留病灶监测、骨髓移植监测等。微小残留病灶监测
14、、骨髓移植监测等。在感染性疾病检测方面，在感染性疾病检测方面，FISHFISH检测痰液标本中铜绿假单饱菌、流感嗜血杆菌等常检测痰液标本中铜绿假单饱菌、流感嗜血杆菌等常见菌的敏感性可以达到见菌的敏感性可以达到9090，特异性，特异性1001009 9。对于军团菌、幽门螺旋杆菌和结。对于军团菌、幽门螺旋杆菌和结核杆菌等较难培养鉴定的细菌，核杆菌等较难培养鉴定的细菌，FISHFISH在快速诊断上也显示了很好的应用前景。在快速诊断上也显示了很好的应用前景。在实体肿瘤的应用中，在实体肿瘤的应用中，FISHFISH可以检测任何组织类型的染色质和基因的异常，广泛可以检测任何组织类型的染色质和基因的异常，广泛
15、应用于肺癌、乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌等实体肿瘤的肿瘤的辅助诊断，疗效检测、应用于肺癌、乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌等实体肿瘤的肿瘤的辅助诊断，疗效检测、个体化治疗和预后判断。个体化治疗和预后判断。FISHFISH用于药物靶向性基因表达状态的检测。在乳腺癌治用于药物靶向性基因表达状态的检测。在乳腺癌治疗药物曲妥珠单抗疗药物曲妥珠单抗(赫赛汀赫赛汀)治疗有效性患者筛选中，治疗有效性患者筛选中，FISHFISH被认为是检测被认为是检测HER2HER2基因基因表达状态的金标准。表达状态的金标准。生物芯片技术生物芯片（生物芯片（BiochipBiochip）是通过微加工技术和微电子技术将大量特定序列）是通过微加
16、工技术和微电子技术将大量特定序列的寡合苷酸片段、抗原的寡合苷酸片段、抗原/抗体，甚至细胞或组织等生物大分子，按照矩抗体，甚至细胞或组织等生物大分子，按照矩阵方式高密度的固定或直接合成在玻璃、硅片、聚丙烯、磁性微球等阵方式高密度的固定或直接合成在玻璃、硅片、聚丙烯、磁性微球等固项支持物上，或者整合微流体技术以及微电级、为传感器等制备的固项支持物上，或者整合微流体技术以及微电级、为传感器等制备的类似于电子行业的芯片样产品的检测技术。固化的探针分子与荧光标类似于电子行业的芯片样产品的检测技术。固化的探针分子与荧光标记的相应样本进行杂交，通过荧光检测系统扫描分析及计算机软件分记的相应样本进行杂交，通过
17、荧光检测系统扫描分析及计算机软件分析，达到高通量分析生物信息的目的。析，达到高通量分析生物信息的目的。生物芯片技术可以根据功能的不同分为微阵列芯片（生物芯片技术可以根据功能的不同分为微阵列芯片（MicroarrayMicroarraychipchip）、微流控芯片（）、微流控芯片（MicrofluidicsMicrofluidics）和芯片实验室（）和芯片实验室（LAB-on-chip,LAB-on-chip,LOCLOC）。）。生物芯片技术微阵列芯片：早期的微阵列芯片（微阵列芯片：早期的微阵列芯片（MicroarrayMicroarray）单指基因芯片（）单指基因芯片（genegenechi
18、pchip，DNAchipDNAchip），但随着蛋白芯片（），但随着蛋白芯片（proteinchipproteinchip）以及糖类芯片）以及糖类芯片（glycanchipglycanchip）的出现，）的出现，MicroarrayMicroarray逐渐被称为微阵列芯片，强调将逐渐被称为微阵列芯片，强调将大量探针有序固化在固相支持物上的检测方法，而根据探针种类的不大量探针有序固化在固相支持物上的检测方法，而根据探针种类的不同可以分为基因芯片、蛋白芯片及糖类芯片。生物芯片技术可以根据同可以分为基因芯片、蛋白芯片及糖类芯片。生物芯片技术可以根据功能的不同分为微阵列芯片（功能的不同分为微阵列芯片
19、（MicroarraychipMicroarraychip）、微流控芯片）、微流控芯片（MicrofluidicsMicrofluidics）和芯片实验室（）和芯片实验室（LAB-on-chip,LOCLAB-on-chip,LOC）。）。微流控芯片：是在几平方厘米的单晶硅片、石英、玻璃或有机聚合物微流控芯片：是在几平方厘米的单晶硅片、石英、玻璃或有机聚合物等材料上刻制微通道，实现样本预处理、反应、分离和检测的微型检等材料上刻制微通道，实现样本预处理、反应、分离和检测的微型检测平台，可快速高效、高通量的完成基因、蛋白及各种小分子分析和测平台，可快速高效、高通量的完成基因、蛋白及各种小分子分析和
20、鉴定鉴定 芯片实验室：是在微流控芯片基础上发展了更为复杂的分析系统，将芯片实验室：是在微流控芯片基础上发展了更为复杂的分析系统，将微机电技术于微流体技术相结合，将所需的反应均集中在一块芯片上，微机电技术于微流体技术相结合，将所需的反应均集中在一块芯片上，建立微型分析系统（建立微型分析系统（MicrototalanalyticalsystemMicrototalanalyticalsystem，u-TASu-TAS）微阵列芯片分析流程蛋白芯片技术糖组芯片技术微流控芯片技术AFP-L3流控芯片芯片技术的应用 目前生物芯片可以应用的范围包括：病原体的快速检测、亚型分析及耐药性检测；肿瘤的分类、分期与
21、筛查；遗传性疾病的诊断于筛查；自身免疫性疾病的诊断等等。国外的生物芯片开发较早，许多成熟的生物芯片的检测平台已逐渐应用于临床，例如美国Osmetch公司的e-SensorCFtest（检测Cysticfibrosis）和RocheAffymetrix的CYP450芯片（检测药物代谢相关基因CYP2D6和CYP2C19），Agendia公司的Mammaprint芯片（检测乳腺癌相关基因），这三种芯片均已获得美国FDA的批准应用于临床实验室sFDA注册主要分子诊断产品（国内企业）基于扩增基础的分子诊断技术及其应用 1983年Mullis发明了聚合酶链式反应（Polymerasechainreact
22、ion，PCR），使体外扩增DNA成为可能，开启了体外扩增和操作DNA或RAN技术的发展。在之后的20多年里，扩增DNA的技术成为分子诊断应用最广的技术之一，发展变化了数十种核酸扩增检测技术。目前缺乏统一的核酸扩增技术的分类，但根据DNA被扩增的过程中是变温还是恒温方式，可以将核酸扩增技术分为两类，温度循环式的扩增技术，以常规（conventionalPCR）和实时PCR（realtimePCR，RT-PCR）为主，等温方式的扩增技术，以核酸序列扩增法（nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA）、转录介导的扩增（Transcription-med
23、iatedamplification，TMA），环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）等技术为主。温度循环式的扩增技术 常规PCR：在扩增反应结束后对产物进行电泳或杂交等方式的分析，因此与其他技术的结合衍生出多种分析方法，例如PCR结合限制性长度多态性分析（PCR-RFLP）、PCR结合特异性寡合苷酸探针斑点杂交（PCR-ASO）、PCR结合变性梯度凝胶（PCR-DGGE）、PCR结合的单链构象多态性（PCR-SSCP）等分析技术。RT-PCR：病原体的多重PCR（MultiplexPCR），提高敏感性和特异性的巢式PCR（nest
24、edPCR），研究基因表达的原位PCR（insituPCR），分析RNA的逆转录PCR（RT-PCR）以及锚定PCR、不对称PCR、膜结合PCR等等。不同方式的PCR技术名称主要用途简并引物扩增法扩增未知基因片断巢式PCR提高pcr敏感性、特异性，分析突变多重PCR同时检测多个突变或病原反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变单一特异引物PCR扩增未知基因组DNA单侧引物PCR通过已知序列扩增未知cDNA原位PCR研究基因表达锚定PCR分析具备不同末端的序列加热变性加热变性冷却粘合冷却粘合扩增扩增连接酶融合连接酶融合冷却冷却聚合酶聚合酶+dNTP+dNTP连接酶连接酶点突变的研究、微生
25、物病原体的检测及定向诱变、单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断、微生物种型鉴定，癌基因的点突变研究连接酶链反应等温方式的扩增技术 恒温扩增技术主要包括，核酸序列扩增法（nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA）、转录介导的扩增（Transcription-mediatedamplification，TMA）、环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）、链置换扩增法（stranddisplacementamplification，SDA）、滚环扩增法（RollingCrileAmpli
26、fication，RCA）、复制酶扩增QB等。等温方式的扩增技术 NASABNASAB：通过：通过AMVAMV逆转录酶、逆转录酶、T7RNAT7RNA聚合酶、聚合酶、RnaseHRnaseH三种酶的协同三种酶的协同作用为核酸扩增提供动力，逆转录酶将作用为核酸扩增提供动力，逆转录酶将RNARNA转录成转录成cDNAcDNA，生成的，生成的RNA-DNARNA-DNA，产物被，产物被RnaseHRnaseH分解为单链分解为单链DNADNA，引物，引物2 2结合结合DNADNA，再在，再在逆转录酶作用下合成双链逆转录酶作用下合成双链DNADNA，双链，双链DNADNA上引物携带的上引物携带的T7RN
27、AT7RNA聚合酶聚合酶的启动子序列将的启动子序列将DNADNA转录成转录成RNARNA，RNARNA又可以生成又可以生成DNADNA，使反应循环，使反应循环发生；发生；TMATMA：使用逆转录酶和：使用逆转录酶和T7RNAT7RNA聚合酶，在反应中同时利用逆转录酶酶聚合酶，在反应中同时利用逆转录酶酶的逆转录活性和的逆转录活性和RnaseRnase活性，反应动力的维系与活性，反应动力的维系与NASBANASBA类似：类似：LAMPLAMP：技术是利用：技术是利用BstDNABstDNA聚合酶的链置换活性提供反应动力；聚合酶的链置换活性提供反应动力；SDASDA：是应用：是应用DNADNA聚合酶
28、的聚合酶的5533核酸外切酶活性从双链核酸外切酶活性从双链DNADNA上的缺上的缺口处开始合成新链，剥离旧链，当缺口重复产生时，切割延伸链口处开始合成新链，剥离旧链，当缺口重复产生时，切割延伸链置换的过程循环进行，目的片段被扩增；置换的过程循环进行，目的片段被扩增；RCARCA：利用环状：利用环状DNADNA与强链置换活性的与强链置换活性的29DNA29DNA聚合酶为聚合酶为DNADNA延伸提延伸提供动力供动力 NSAB 操作简便操作简便 不需特殊仪器不需特殊仪器 不需温度循环不需温度循环 循环次数少循环次数少 忠实性高忠实性高 特异性好特异性好 扩增效率高于标准扩增效率高于标准PCRPCRT
29、MA以扩增为基础的方法的临床应用 DNADNA或或RNARNA的扩增技术，最直接的优势是在较短的时间内将目的基因的扩增技术，最直接的优势是在较短的时间内将目的基因的拷贝数大量扩增，具有很高的灵敏度，同时特异性的引物保证了较的拷贝数大量扩增，具有很高的灵敏度，同时特异性的引物保证了较高的特异性。因此，在分子诊断技术中基于扩增的技术，特别是荧光高的特异性。因此，在分子诊断技术中基于扩增的技术，特别是荧光定量定量PCRPCR技术，在实验诊断中应用最为广泛。技术，在实验诊断中应用最为广泛。PCRPCR技术可以准确的定技术可以准确的定量感染性疾病病原体，不论是真菌、细菌和病毒以及寄生虫的感染都量感染性疾
30、病病原体，不论是真菌、细菌和病毒以及寄生虫的感染都可以应用扩增技术加以检测，同时同一种病原体可以买到多种扩增原可以应用扩增技术加以检测，同时同一种病原体可以买到多种扩增原理的商业化检测试剂。目前在理的商业化检测试剂。目前在sFDAsFDA注册的应用注册的应用PCRPCR方法的体外诊断试方法的体外诊断试剂已达到剂已达到190190余种，成为病原体和基因表达与突变检测的最主要的试剂。余种，成为病原体和基因表达与突变检测的最主要的试剂。为提高为提高PCRPCR的检测通量，新进发展的多重的检测通量，新进发展的多重PCRPCR技术以及多重连接探针技术以及多重连接探针扩增技术（扩增技术（Multiplex
31、ligation-dependentProbeamplificationMultiplexligation-dependentProbeamplification，MLPAMLPA）可以一次在同一样本中同时检测多种病原体，最大可同时扩增）可以一次在同一样本中同时检测多种病原体，最大可同时扩增4545个目的片段。同时，对个目的片段。同时，对PCRPCR产物的高分辨率溶解曲线分析，为基因产物的高分辨率溶解曲线分析，为基因分型和突变扫描提供了新的手段。可以预见分型和突变扫描提供了新的手段。可以预见PCRPCR技术仍将主导临床实技术仍将主导临床实验室感染性病原体的检测，细菌的耐药基因检测，肿瘤个体化治
32、疗的验室感染性病原体的检测，细菌的耐药基因检测，肿瘤个体化治疗的主要检测工具。主要检测工具。基于测序基础的分子诊断技术及其应用 人类基因组计划的出现人类基因组计划的出现,使人们面临了巨大的经费问题使人们面临了巨大的经费问题,因为传统的因为传统的SangerSanger测序法无论如何优化测序法无论如何优化,也无也无 法大幅度降低测序费用法大幅度降低测序费用;人类以及其它主要模式生物参考序列数据库的建立使得短片段作图成人类以及其它主要模式生物参考序列数据库的建立使得短片段作图成为可能为可能,这极大地促进了短片段测序技术的发展这极大地促进了短片段测序技术的发展;不断涌现的新型分子生物学技术极大地促进
33、了分子生物学的发展不断涌现的新型分子生物学技术极大地促进了分子生物学的发展,随之随之而来的越来越多的比如基因变异、而来的越来越多的比如基因变异、RNARNA表达、蛋白与表达、蛋白与DNADNA相互作用以相互作用以及染色体构象等等生物学现象需要人们用高通量及染色体构象等等生物学现象需要人们用高通量DNADNA测序手段去解释测序手段去解释,这也极大地促进了新型测序技术的发展这也极大地促进了新型测序技术的发展;其它学科、各项相关技术的发展其它学科、各项相关技术的发展,例如显微镜技术、表面化学技术、核例如显微镜技术、表面化学技术、核苷生化技术、聚合酶工程技术、苷生化技术、聚合酶工程技术、计算机技术、数
34、据储存及分析技术等计算机技术、数据储存及分析技术等,为为DNADNA测序技术提供了极大的支持。测序技术提供了极大的支持。测序技术发展的动力新一代测序仪 美国RocheAppliedScience公司的454基因组测序仪 美国Illumina公司和英国Solexatechnology公司合作开发的Illumina测序仪 美国AppliedBiosystems公司的SOLiD测序仪 Dover/Harvard公司的Polonator测序仪 美国Helicos公司的HeliScope单分子测序仪新一代测序原理 新的测序策略循环芯片测序法(cyclic-arraysequencing)循环芯片测序法,
35、简言之就是对布满DNA样品的芯片重复进行基于DNA的聚合酶反应(模板变性、引物退火杂交及延伸)以及荧光序列读取反应 与传统测序法相比,循环芯片测序法具有操作更简易、费用更低廉的优势新一代测序仪的特点 体外构建体外构建DNADNA文库文库,随后体外克隆扩增待测随后体外克隆扩增待测DNADNA片段片段,这就解决了传统这就解决了传统SangerSanger测序技术中好几个限制测序技术中好几个限制 平行测序规模的瓶颈问题平行测序规模的瓶颈问题,比如转化大肠比如转化大肠杆菌以及阳性克隆挑选等问题杆菌以及阳性克隆挑选等问题;基于芯片的测序方式能极大地提高平行测序的能力。由于每一个待测基于芯片的测序方式能极
36、大地提高平行测序的能力。由于每一个待测DNADNA片段克隆的直径都不到片段克隆的直径都不到 1m,1m,因此可以在芯片上同时对上亿个待测因此可以在芯片上同时对上亿个待测DNADNA片段进行测序。片段进行测序。因为每一个待测因为每一个待测DNADNA片段克隆都固定在芯片上的固定位置片段克隆都固定在芯片上的固定位置,因此可以一因此可以一次对芯片上的所有片段进行测次对芯片上的所有片段进行测 序序,而只需要使用几微升的酶等反应试剂而只需要使用几微升的酶等反应试剂,这就相当于每一个待测片段只使用了几皮升这就相当于每一个待测片段只使用了几皮升(picoliter)(picoliter)或或 几飞升几飞升(
37、femtoliter)(femtoliter)的反应试剂的反应试剂,从而极大降低了测序反应的费用从而极大降低了测序反应的费用;测序片段长度短测序片段长度短:几乎所有的新一代测序技术的测序长度都要明显短于几乎所有的新一代测序技术的测序长度都要明显短于传统测序技术的测序长度传统测序技术的测序长度;准确率不高准确率不高:平均来说平均来说,新一代测序技术的测序准确率要比传统测序技术新一代测序技术的测序准确率要比传统测序技术低低1010倍。倍。454测序仪Illumina测序仪SOLID和HeliScope测序新一代测序仪的应用分子诊断技术的应用前景全球分子诊断市场提供分子诊断技术服务的主要国外制造商感染性疾病分子诊断市场癌症分子诊断市场韩国分子诊断应用统计检测方法的多样性EGFR测定方法 测序法 聚合酶链式反应单链构象多态性分析（PCR-SSCP）探针扩增阻滞突变系统（amplificationrefractorymutationsystem，ARMS），等位基因特异PCR 微数字PCR（microfluidicsdigitalPCR）高分辨率溶解曲线分析技术（highresolutionmeltinganalysis，HRM）高效液相色谱法（denaturinghigh-performanceliquidchromatograph，DHPLC）谢谢！