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1、课题2：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数导入新课导入新课 上一节课我们已经学习了培养基的配制上一节课我们已经学习了培养基的配制以及接种技术，现在我们就来学习如何从土以及接种技术，现在我们就来学习如何从土壤中将我们需要的微生物进行分离。壤中将我们需要的微生物进行分离。土壤土壤微生物微生物尿素是一种重要的农业氮肥，分子式为H2NCONH2，不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。原因:土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2)2 2+H+H2 2O O脲酶脲酶COCO2 2+2NH+2NH3 3一、研究思路一、研究思路二、实验设计二、实验设计三
2、、结果分析与评价三、结果分析与评价四、课题延伸四、课题延伸 你能想一想怎样能将分解尿素你能想一想怎样能将分解尿素的细菌从土壤中分离出来吗？的细菌从土壤中分离出来吗？想一想想一想（一）筛选菌株（一）筛选菌株耐热微生物耐热微生物温泉温泉耐寒微生物耐寒微生物冰川冰川分解石油的细菌分解石油的细菌油田油田筛选原则：筛选原则：根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。实例：实例：Taq DNA聚合酶的发现聚合酶的发现 DNA多聚酶链式反应是一种在多聚酶链式反应是一种在体外将少量体外将少量DNA大量复制的技术。大量复制的技术。此项技术的自动化，要求使
3、用耐高此项技术的自动化，要求使用耐高温的温的DNA聚合酶，该去哪里寻找？聚合酶，该去哪里寻找？科学家是从水生耐热细菌科学家是从水生耐热细菌 Taq中分离到耐高温的中分离到耐高温的Taq DNA聚合酶聚合酶的。的。美国黄石国家公园的一个热泉美国黄石国家公园的一个热泉2、选择培养基、选择培养基p 定义定义 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养基。其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养基。p 选择培养基配方选择培养基配方葡萄糖葡萄糖10.0g尿素尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO47H2
4、00.2g琼脂琼脂15.0g蒸馏水蒸馏水1000ml 在左图的培养在左图的培养基配方中，碳源和基配方中，碳源和氮源分别是什么？氮源分别是什么？碳源碳源葡萄糖、葡萄糖、尿素尿素氮源氮源尿素尿素u1、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。不能区分死菌与活菌；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点（二）统计菌落的数目u2、稀释涂布平板法（活菌计数法）原理：原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。稀释液中的一个活菌。恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键。恰当的稀
5、释度是成功统计菌落数目的关键。样品稀释培养示意图样品稀释培养示意图选选 3030 300 300 个菌落的平板统计。个菌落的平板统计。每个稀释度取每个稀释度取3 3个平板取其平均值。个平板取其平均值。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。每克样品中的菌落数(CV)MC代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。是排除实验组中非测试因素对是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。实验结果的影响，提高实验结果的可信度。（三）设置对照：（三）设置对照：（1 1）设置对照的目的：）设置对照的目的
6、：（2 2）对照实验：）对照实验：指除了被测试的条件外，其他条件都指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。相同的实验。实验组：实验组：对照组：对照组：设置对照设置对照 -同等条件下，培养空白培养基。同等条件下，培养空白培养基。菌落计数菌落计数配制土壤溶液配制土壤溶液系列稀释系列稀释涂布平板与培养涂布平板与培养 实例：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，目的实验时，A A同学同学从对应的从对应的10106 6倍稀释的培养基中筛选倍稀释的培养基中筛选出大约出大约150150个菌落，但是个菌落，但是其他同学其他同学在同样的稀释度下只在同样的稀
7、释度下只选择出大约选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原因：原因：土样不同，土样不同，培培养养基基污污染染或或操操作作失失误误(或或者者是是混混入入了了其其他他的的含含氮物质氮物质)小结：小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：方案二：将将A A同学配制的培养基在不加土样的情况下进同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。行培养，作为空
8、白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A A同学一致，则证明同学一致，则证明A A无误；如果结果不无误；如果结果不同，则证明同，则证明A A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。同学存在操作失误或培养基的配制有问题。菌落计数菌落计数配制土壤配制土壤溶液溶液系列稀释系列稀释涂布平板与涂布平板与培养培养土壤中细菌分离与计数示意图土壤中细菌分离与计数示意图实验具体操作步骤：实验具体操作步骤：1、土壤取样、土壤取样 从富含有机物、潮湿、酸碱度适中的土壤中取样。铲从富含有机物、潮湿、酸碱度适中的土壤中取样。铲去表层土去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封
9、左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。中。“微生物的天然培养基”数量最大、种类最多大约70%90%是细菌u制备选择培养基（尿素为唯一氮源）u制备牛肉膏蛋白胨培养基（对照作用）思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？2、制备培养基、制备培养基 3、样品的稀释、样品的稀释分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板（1 1）测细菌数：一般用）测细菌数：一般用10104 4、10105 5、10106 6稀释液稀释液 （2 2）测放线菌：一般用）测放线菌：一般用10103 3、10104 4、10105 5稀释液稀释液 （3
10、 3）测真菌数：一般用）测真菌数：一般用10102 2、10103 3、10104 4稀释液稀释液按浓度捆成一摞恒温37培养4、微生物的培养与观察、微生物的培养与观察培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。观观 察察 1 1、在菌落计数时，每隔、在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样以防止这样以
11、防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目目。2 2、以、以“稳定菌落稳定菌落”为观察对象。为观察对象。原因：不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形原因：不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，特征，菌落特征菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。可作为菌种鉴定的重要依据。不同形态的菌落不同形态的菌落不同形态的菌落不同形态的菌落（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落出菌落 对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明
12、培养基没有对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。（二）样品的稀释操作是否成功（二）样品的稀释操作是否成功 如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在3030300300的平板，则说明的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。（三）重复组的结果是否一致（三）重复组的结果是否一致 如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该
13、接近。如果如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，教师需要引导学生一起分析产生差异的原因。结果相差太远，教师需要引导学生一起分析产生差异的原因。结果分析与评价结果分析与评价课题延伸课题延伸pHpH升高升高指示剂（酚红）将变红指示剂（酚红）将变红CO(NHCO(NH2 2)2 2+H+H2 2O O脲酶脲酶COCO2 2+2NH+2NH3 3研究研究思路思路实验设计实验设计筛选菌株筛选菌株选择培养选择培养筛选原则筛选原则统计菌落数目统计菌落数目操作提示操作提示无菌操作无菌操作做好标记做好标记选择培养基选择培养基定义定义配方配方目的目的定义定义土壤取样土壤取样配制培养基配制培养基制定计划制定计划结果分析与评价结果分析与评价土壤土壤中分中分解尿解尿素的素的细菌细菌的分的分离与离与计数计数设置对照设置对照微生物培养与观察微生物培养与观察细菌的计数细菌的计数课堂小结课堂小结