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1、蛋白质离子交换层析技术蛋白质离子交换层析技术 蛋白质离子交换层析技术蛋白质离子交换层析技术离子交换层析原理离子交换层析原理离子交换层析原理离子交换层析原理离子交换剂离子交换剂离子交换剂离子交换剂实验条件的确定实验条件的确定实验条件的确定实验条件的确定具体操作方法具体操作方法具体操作方法具体操作方法常见问题及处理常见问题及处理常见问题及处理常见问题及处理12345应用实例应用实例应用实例应用实例61.离子交换层析的原理以离子交换剂为固定相，依据流动相中的以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子组分离子与交换与交换剂上的剂上的平衡离子平衡离子进行可逆交换时的进行可逆交换时的结合力大小结合力大小
2、的差别而进的差别而进行分离的一种层析方法。行分离的一种层析方法。蛋白质（以蛋白质（以静电引力静电引力为主）的离子交换层析为主）的离子交换层析两性分子，不同pH，所带电荷种类和数目不同所带电荷种类和数目不同高级结构，大分子，大分子，多位点吸附除静电力还有氢键、疏水作用、范德华力等待分离的目标分子和杂质一起进入平衡后的离子交换剂，目标分子和杂待分离的目标分子和杂质一起进入平衡后的离子交换剂，目标分子和杂质因带电量不同，与离子交换剂有不同的结合程度，通过逐渐增加盐离质因带电量不同，与离子交换剂有不同的结合程度，通过逐渐增加盐离子浓度，将目标分子和杂质分别洗脱下来，从而实现目标分子和杂质的子浓度，将目
3、标分子和杂质分别洗脱下来，从而实现目标分子和杂质的分离。分离。2.2.离子交换剂离子交换剂基本结构基本结构2.1指标指标2.2分类分类2.32.1离子交换剂的基本结构基质应具备的特点：基质应具备的特点：机械稳定性强机械稳定性强，适合高流速，适合高流速化学稳定性好化学稳定性好，在很宽的，在很宽的pH范围内保持稳定，能耐去污范围内保持稳定，能耐去污剂、有机溶剂。剂、有机溶剂。球形，颗粒均匀。球形，颗粒均匀。亲水性亲水性。高交换容量高交换容量，要有较大的孔径，要有较大的孔径。水不溶性基质水不溶性基质水不溶性基质水不溶性基质活性基团活性基团活性基团活性基团平衡离子平衡离子平衡离子平衡离子+平衡离子平衡
4、离子2.2离子交换剂的指标 交换容量交换容量交换容量交换容量：离子交换剂能结合溶液中可交换离子的能力，离子交换剂能结合溶液中可交换离子的能力，通常用有效交换容量和实际交换容量来表示。通常用有效交换容量和实际交换容量来表示。膨胀度：膨胀度：干态的交换剂吸水后造成体积膨胀的程度。干态的交换剂吸水后造成体积膨胀的程度。粒径：粒径：一一般都在般都在3-300m交联度及网孔结构：交联度及网孔结构：交交联度越高，机械强度越好，耐压性联度越高，机械强度越好，耐压性能越好。能越好。电荷密度：电荷密度：基质颗粒单位表面积的取代基数量。对于蛋白基质颗粒单位表面积的取代基数量。对于蛋白质，介质的电荷密度往往较低。以
5、免结合过牢，难以洗脱质，介质的电荷密度往往较低。以免结合过牢，难以洗脱且易变性。且易变性。粒径粒径分辨率分辨率，分离效果，分离效果，但流速，但流速实际交换容量实际交换容量指每克干介质或每毫升湿胶包含的带电功能基团的数量指每克干介质或每毫升湿胶包含的带电功能基团的数量指每克干介质或每毫升湿胶包含的带电功能基团的数量指每克干介质或每毫升湿胶包含的带电功能基团的数量有效交换容量有效交换容量指每克干介质或每毫升湿胶在一定的实验条件下吸附某指每克干介质或每毫升湿胶在一定的实验条件下吸附某指每克干介质或每毫升湿胶在一定的实验条件下吸附某指每克干介质或每毫升湿胶在一定的实验条件下吸附某物质的实际容量物质的实
6、际容量物质的实际容量物质的实际容量2.3离子交换剂的分类根据活性基团的酸碱性质和解离性质：根据活性基团的酸碱性质和解离性质：酸碱性质：酸碱性质：解离性质：解离性质：阳离子交换剂：阳离子交换剂：活性基团为酸性，结合阳离子活性基团为酸性，结合阳离子阴离子交换剂：阴离子交换剂：活性基团为碱性，结合阴离子活性基团为碱性，结合阴离子强离子交换剂：强离子交换剂：活性基团为强酸强碱活性基团为强酸强碱弱离子交换剂：弱离子交换剂：活性基团为弱酸弱碱活性基团为弱酸弱碱类型类型名称名称英文符号英文符号阴离子阴离子强碱强碱季铵基季铵基Q Q季铵基乙基季铵基乙基QAEQAE弱碱弱碱二乙氨基乙基二乙氨基乙基DEAEDEA
7、E阳离子阳离子强酸强酸磺丙基磺丙基SPSP磺乙基磺乙基SESE弱酸弱酸羧甲基羧甲基CMCM蛋白质分离纯化时，条件必须温和，通常用蛋白质分离纯化时，条件必须温和，通常用蛋白质分离纯化时，条件必须温和，通常用蛋白质分离纯化时，条件必须温和，通常用弱弱弱弱离子交换剂离子交换剂离子交换剂离子交换剂2.3离子交换剂的分类由于树脂的孔径过小，且电荷密度过高，疏水性过强由于树脂的孔径过小，且电荷密度过高，疏水性过强使得大分子结合过牢而不易洗脱，同时，会造成变性。使得大分子结合过牢而不易洗脱，同时，会造成变性。通常用于蛋白质的离子交换剂多为纤维素等多糖类。通常用于蛋白质的离子交换剂多为纤维素等多糖类。多糖类多
8、糖类多糖类多糖类其它其它其它其它2.3离子交换剂的分类开放性长链，较大的表面积，吸附容量最大开放性长链，较大的表面积，吸附容量最大离子基团少，排列稀疏，与蛋白质结合不太牢固，易于洗离子基团少，排列稀疏，与蛋白质结合不太牢固，易于洗脱脱良好的稳定性，洗脱剂的选择范围广良好的稳定性，洗脱剂的选择范围广纤维素纤维素纤维素纤维素2.3离子交换剂的分类目前使用交联葡聚糖主要来自目前使用交联葡聚糖主要来自Pharmacia公司，主要有公司，主要有4种类型，都是以种类型，都是以SephadexG为骨架为骨架商品名分别为商品名分别为SephadexA-25 SephadexC-25 SephadexA-50
9、SephadexC-50SephadexA-25以以SephadexG，即交联，即交联葡聚糖为骨架葡聚糖为骨架A:阴离子阴离子C:阳离子阳离子凝胶吸水值的凝胶吸水值的10倍倍2525为每克凝胶膨胀时吸水为每克凝胶膨胀时吸水2.52.5克克葡聚糖葡聚糖葡聚糖葡聚糖2.3离子交换剂的分类123TECHNOSepharose系列系列SepharoseCL-6BBio-Gel系系列列34m90m200m90m粒径粒径粒径粒径大孔珠状大孔珠状颗粒状颗粒状Q型型SP型型SepharoseHP弱型（弱型（DEAE，ANXCM）强型（强型（Q，SP）SepharoseFFQ型型SP型型SepharoseBBD
10、E型型CM型型琼脂糖琼脂糖琼脂糖琼脂糖2.3离子交换剂的分类高效型：高效型：SOURCE系列、系列、MonoBeads系列系列刚性的骨架结构：高硬度、高流速刚性的骨架结构：高硬度、高流速亲水表面：低特异性吸附亲水表面：低特异性吸附非孔非孔型型：MiniBeads系列系列所有的结合都发生在颗粒表面所有的结合都发生在颗粒表面液膜扩散小，快速；颗粒小，分辨率高液膜扩散小，快速；颗粒小，分辨率高聚乙烯醇型：聚乙烯醇型：Toyopearl系列系列多孔型三维网状结构，富含羟基，高度亲水多孔型三维网状结构，富含羟基，高度亲水其它其它其它其它无孔型无孔型有孔型有孔型无孔型无孔型微孔型微孔型大孔型大孔型无孔型，
11、交换发生在表面；无孔型，交换发生在表面；无孔型，交换发生在表面；无孔型，交换发生在表面；有孔型，需进入基质内部再发生交换有孔型，需进入基质内部再发生交换有孔型，需进入基质内部再发生交换有孔型，需进入基质内部再发生交换2.3离子交换剂的分类高效型：高效型：SOURCE系列、系列、MonoBeads系列系列刚性的骨架结构：高硬度、高流速刚性的骨架结构：高硬度、高流速亲水表面：低特异性吸附亲水表面：低特异性吸附非孔非孔型型：MiniBeads系列系列所有的结合都发生在颗粒表面所有的结合都发生在颗粒表面液膜扩散小，快速；颗粒小，分辨率高液膜扩散小，快速；颗粒小，分辨率高聚乙烯醇型：聚乙烯醇型：Toyo
12、pearl系列系列多孔型三维网状结构，富含羟基，高度亲水多孔型三维网状结构，富含羟基，高度亲水其它其它其它其它3.3.实验实验条件条件的确定的确定离子交换剂离子交换剂3.1色谱柱色谱柱3.2缓冲液缓冲液3.33.1离子交换剂按规模：按规模：分析型分离，一般用柱色谱；大规模工业化分离，分析型分离，一般用柱色谱；大规模工业化分离，有柱色谱、膨胀床吸附、分批分离等多种模式有柱色谱、膨胀床吸附、分批分离等多种模式按目的：按目的：在预处理和初分级阶段，目的是提取和浓缩目标在预处理和初分级阶段，目的是提取和浓缩目标分子；在细分级和最后的精制阶段，目的是去除杂质，获分子；在细分级和最后的精制阶段，目的是去除
13、杂质，获得单一组分。得单一组分。目标分子的大小：目标分子的大小：选择合适孔径的基质选择合适孔径的基质目标分子的电荷及目标分子的电荷及pH稳定性：稳定性：在起始缓冲液中，目标分子和介质的功能基团带相反的电在起始缓冲液中，目标分子和介质的功能基团带相反的电荷，以利于目标分子结合在色谱柱上，荷，以利于目标分子结合在色谱柱上，起始相洗脱，杂质和介质的功能基团带相反的电荷，从而起始相洗脱，杂质和介质的功能基团带相反的电荷，从而吸附在色谱柱上。这时，收集流穿峰即可。吸附在色谱柱上。这时，收集流穿峰即可。3.2色谱柱通常用高径比较小的柱子通常用高径比较小的柱子离子交换柱的高度一般在离子交换柱的高度一般在5-
14、20cm确定基本参数后，可通过直径确定基本参数后，可通过直径扩大分扩大分离规模。离规模。3.3缓冲液缓冲离子：缓冲离子：与功能基团带相同的电荷与功能基团带相同的电荷pH：蛋白质的蛋白质的pI缓冲液的缓冲液的pH缓冲液的种类缓冲液的种类 离子强度：离子强度：离子强度离子强度利于洗脱，不利于吸附利于洗脱，不利于吸附4.离子交换的操作方法离子交换的操作方法预处理预处理4.1装柱、平衡装柱、平衡4.2上样、洗涤上样、洗涤4.3洗脱洗脱4.4色谱柱的再生色谱柱的再生4.54.1预处理预装柱：预装柱：SOURCE、MonoBeads、MiniBeads系列系列 无需处理，直接使用。无需处理，直接使用。湿胶
15、湿胶：无需预处理，使用前倾去上清，添加起始缓冲液，无需预处理，使用前倾去上清，添加起始缓冲液，搅匀后装柱即可搅匀后装柱即可干胶干胶：需溶胀。通常室温需溶胀。通常室温1-2d，沸水浴，沸水浴2h。Sephadex系列：系列：不能用蒸馏水，避免强烈搅拌。不能用蒸馏水，避免强烈搅拌。纤维素系列：纤维素系列：制造制造的过程中，产生一些细颗粒，将纤维素在水中搅的过程中，产生一些细颗粒，将纤维素在水中搅 匀后，自然沉降，匀后，自然沉降，倾去上清漂浮物倾去上清漂浮物，反复数次即可。，反复数次即可。制造完后，未经处理，含很多杂质成分，需洗涤，用制造完后，未经处理，含很多杂质成分，需洗涤，用 0.5mol/L的
16、的NaOH和和0.5mol/L的的HCl进行进行“碱碱-酸酸-碱碱”反反复浸泡复浸泡，每次半小时，期间用蒸馏水洗至中性。，每次半小时，期间用蒸馏水洗至中性。4.2装柱、平衡装柱：装柱：排空柱底部的死体积，轻轻搅匀交换剂与缓冲液的排空柱底部的死体积，轻轻搅匀交换剂与缓冲液的混合液，玻棒引流，使液体沿柱壁流下，尽可能一次性注混合液，玻棒引流，使液体沿柱壁流下，尽可能一次性注入，让介质自然沉降。入，让介质自然沉降。保持柱的垂直状态，防止产生气泡、防止分层保持柱的垂直状态，防止产生气泡、防止分层。平衡：平衡：用起始缓冲液平衡，检测下端流出液与起始缓冲液用起始缓冲液平衡，检测下端流出液与起始缓冲液在在p
17、H、电导、离子强度方面是否达一致。、电导、离子强度方面是否达一致。对于弱离子交换剂，本身具有一定的缓冲能力，平衡时间对于弱离子交换剂，本身具有一定的缓冲能力，平衡时间很长。通常用酸或碱将很长。通常用酸或碱将pH调至起始调至起始pH；或用与起始缓冲；或用与起始缓冲液液pH相同，但离子强度更大的缓冲液，加快相同，但离子强度更大的缓冲液，加快pH平衡，最平衡，最后用起始缓冲液平衡。后用起始缓冲液平衡。4.3上样、洗涤上样上样 加样量加样量：目的物含量为有效交换容量的：目的物含量为有效交换容量的10-20%。方法：方法：预装柱，通过恒流泵加样。预装柱，通过恒流泵加样。自装柱，采用排干法：自装柱，采用排
18、干法：加样时，不能搅动床面，要保持床面的完整。加样时，不能搅动床面，要保持床面的完整。洗涤洗涤 加样完后，用起始缓冲液填满柱上端，拧紧上口，用恒流加样完后，用起始缓冲液填满柱上端，拧紧上口，用恒流泵泵入起始缓冲液泵泵入起始缓冲液4.4洗脱缓冲离子：缓冲离子：与功能基团带相同的电荷与功能基团带相同的电荷pH：蛋白质的蛋白质的pI缓冲液的缓冲液的pH缓冲液的种类缓冲液的种类离子强度离子强度：离子强度离子强度利于洗脱，不利于吸附利于洗脱，不利于吸附4.4洗脱-般采用分部洗脱和连续洗脱。般采用分部洗脱和连续洗脱。分部洗脱：分部洗脱：几种不同洗脱能力的缓冲液相继进行洗脱几种不同洗脱能力的缓冲液相继进行洗
19、脱优点：设备和操作简单；洗脱迅速；洗脱液体积小优点：设备和操作简单；洗脱迅速；洗脱液体积小缺点：性质相近的组分不易分开；同一组分出现多个峰缺点：性质相近的组分不易分开；同一组分出现多个峰连续洗脱连续洗脱：逐渐增强洗脱缓冲液的洗脱能力，分辨率逐渐增强洗脱缓冲液的洗脱能力，分辨率梯度混合器梯度混合器梯度混合器梯度混合器4.5色谱柱的再生与清洗一般，高浓度盐（通常是一般，高浓度盐（通常是2M的的NaCl）溶液清洗）溶液清洗对于一些结合较牢固的物质，如变性的蛋白，沉淀而聚集对于一些结合较牢固的物质，如变性的蛋白，沉淀而聚集的蛋白，疏水性蛋白或脂蛋白等一些胶状物，用酸和碱洗的蛋白，疏水性蛋白或脂蛋白等一
20、些胶状物，用酸和碱洗脱脱疏水性更强的蛋白、脂蛋白以及脂类，用非离子去污剂或疏水性更强的蛋白、脂蛋白以及脂类，用非离子去污剂或有机溶剂（有机溶剂（70%的乙醇或的乙醇或30%异丙醇）逆向清洗。异丙醇）逆向清洗。琼脂糖琼脂糖：盐和：盐和0.5M的的NaOH纤维素：纤维素：盐和盐和0.1M的的NaOH葡聚糖葡聚糖：避免在：避免在pH小于小于3的环境，可用的环境，可用1M的的NaAC 0.5M的的NaOH交替清洗。交替清洗。5.常见问题及处理常见问题及处理层析速度太慢层析速度太慢5.1蛋白质不与树脂结合蛋白质不与树脂结合5.2纯化蛋白质的产率低纯化蛋白质的产率低5.3蛋白质分辨效果差蛋白质分辨效果差5
21、.45.1层析速度太慢问题问题问题问题处理处理处理处理5.2蛋白质不与树脂结合问题问题问题问题处理处理处理处理5.3纯化蛋白质的产率低问题问题问题问题处理处理处理处理5.4蛋白质分辨效果差问题问题问题问题处理处理处理处理6.6.应用实例应用实例混合物的分离混合物的分离6.1蛋白质的柱上复性蛋白质的柱上复性6.26.1混合物的分离Bio-Rex70层析分离眼镜蛇神经毒素的层析分离眼镜蛇神经毒素的6种单乙酰基衍生物种单乙酰基衍生物 眼镜蛇神经毒素，一种小分子碱性蛋白，分子中眼镜蛇神经毒素，一种小分子碱性蛋白，分子中6个氨基个氨基（5个侧链个侧链Lys残基和一个游离的残基和一个游离的N端氨基）均能被
22、乙酰化端氨基）均能被乙酰化生成乙酰基衍生物生成乙酰基衍生物,形成的形成的6种单乙酰基衍生物中净电荷数种单乙酰基衍生物中净电荷数相同，但表面的电荷分布不同。据此，可以用相同，但表面的电荷分布不同。据此，可以用Bio-Rex70将它们分开。将它们分开。6.1混合物的分离两步连续离子交换制备色谱分离纯化两步连续离子交换制备色谱分离纯化PEG-rhG-SCF 蛋白质聚乙二醇化的反应，生成非蛋白质聚乙二醇化的反应，生成非PEG化蛋白和不同程度化蛋白和不同程度的的PEG化蛋白的混合物。因蛋白质化蛋白的混合物。因蛋白质PEG化程度越高，其等化程度越高，其等电点越低，根据电荷量的差异，通过电点越低，根据电荷量
23、的差异，通过SP-SepharoseFF和和SOURSE Q30作为阳、阴离子色谱连续两步将之分离开来。作为阳、阴离子色谱连续两步将之分离开来。6.1混合物的分离 蛋白质蛋白质PEG化程度越高，其等电点越低。化程度越高，其等电点越低。在阳离子交换色谱，在阳离子交换色谱，PEG化蛋白与介质结合较弱，主要出化蛋白与介质结合较弱，主要出现在流穿峰中，通过洗脱液将非现在流穿峰中，通过洗脱液将非PEG化蛋白洗脱下来。而化蛋白洗脱下来。而在阴离子交换色谱中，由于在阴离子交换色谱中，由于PEG的的“屏蔽效应屏蔽效应”阻碍了蛋阻碍了蛋白与交换剂间的作用，白与交换剂间的作用，PEG化程度高的蛋白反而易被洗脱。化
24、程度高的蛋白反而易被洗脱。SP-SepharoseFF分离聚乙分离聚乙二醇化的二醇化的rhG-CSF和未反应和未反应的的rhG-CSFSOURSE Q30阴离子交换色谱阴离子交换色谱分离不同的修饰组分分离不同的修饰组分峰峰3，2，1分别代表单、双、三分别代表单、双、三聚乙二醇化蛋白聚乙二醇化蛋白6.2包涵体蛋白的柱上复性吸附：吸附：用变性缓冲液用变性缓冲液溶解蛋白，溶解蛋白，用变性缓冲液平衡色谱柱，用变性缓冲液平衡色谱柱，使伸展的变性蛋白使伸展的变性蛋白吸附吸附到介质表面。色谱柱有效分隔蛋白到介质表面。色谱柱有效分隔蛋白质分子，抑制分子间的聚集。质分子，抑制分子间的聚集。复性：复性：复性缓冲液
25、相对于变性缓冲液，只少变性剂，其它复性缓冲液相对于变性缓冲液，只少变性剂，其它成分都一样。变性剂的线性减少能有效抑制复性聚集体的成分都一样。变性剂的线性减少能有效抑制复性聚集体的形成，且利于蛋白在柱上的自发折叠。形成，且利于蛋白在柱上的自发折叠。洗脱：洗脱：用含高浓度盐的洗脱缓冲液，洗脱折叠后的蛋白。用含高浓度盐的洗脱缓冲液，洗脱折叠后的蛋白。6.2包涵体蛋白的柱上复性离子交换层析复性离子交换层析复性rh-IFN折折叠二聚体叠二聚体 A液（液（6M Urea，50mM PBS，pH7.0）溶解变性的包涵体）溶解变性的包涵体蛋白，并用蛋白，并用A液平衡液平衡SP-SepharoseFF柱。此时，
26、由于高浓柱。此时，由于高浓度的变性剂的存在，使度的变性剂的存在，使rh-IFN去折叠并吸附到柱上，单个去折叠并吸附到柱上，单个蛋白彼此分开。蛋白彼此分开。B1液（液（50mM PBS，pH7.0）和）和A液混合过柱，形成线性液混合过柱，形成线性减少的尿素浓度梯度，以诱使吸附在柱上的蛋白复性，同减少的尿素浓度梯度，以诱使吸附在柱上的蛋白复性，同时减少复性中间体的聚集。时减少复性中间体的聚集。B2液（液（1M NaCl，50mM PBS，pH7.0）将复性后的蛋白）将复性后的蛋白洗脱下来。洗脱下来。复性后的复性后的rh-IFN的纯度达的纯度达 95%,蛋白收率达蛋白收率达 54%,比活比活为为 7.5 105 IU/mg-1Thanks for attention