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1、工程名称：胸腺与免疫细胞发育的分子调控起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：中国科学院年度研究内容预期目标IFN- P启动子基因报告系统筛选参与天然免 疫细胞分化和应答的重要调控因子。10）参与果蝇天然免疫调控相关新基因的遗 传和生化筛选。11）完成 ETS 转录因子 Fev, Ets2, Gabpa, Elf2,和Elk4在野生型和三种不同血细胞突 变体斑马鱼（c/oMe, spade的了/和e tsrp） 胚胎发育不同时期中的时空表达图谱。12）构建新ETS转录因子相应的pCS2+表达 载体；设计并开展相关基因的反义寡聚核背 酸 Morpholinos 实验。13）开展小规模的
2、ENU化学诱变，初步筛选一 批影响胸腺和T细胞发生的突变体。14）进行相关基因进化分析。确立三种模式 动物免疫发育相关的候选基因，并完成相关 的进化研究。建立和完善本工程相关的各种 技术平台。第年1）进一步凭借FoxNl： GFP或Ragl:GFP绿色 荧光转基因斑马鱼报告系筛选对胸腺发育发 育起重要作用的局部基因。2）应用生物工程技术改造小鼠、移植动物模 型及细胞分子生物学研究手段，较深入研究 候选基因（如EP2/4）、AIRE及FoxNl通路等 在胸腺上皮细胞干细胞及胸腺上皮细胞发 育、衰老的作用及调控网络。3）确定Aire对胸腺髓质上皮细胞分化和作 用的影响并确定其分子机制。获得一批对造
3、血、胸腺、免 疫细胞发育有影响的基因。 初步构建较系统的造血干细 胞基因调控网络模式图。分析端粒DNA相关蛋白P28 在胸腺及免疫细胞衰老过程 中与端粒动力学相关性。获得相关基因进化表位的基 础数据，得到初步结论。在主流杂志上发表论文至少年度研究内容预期目标4）系统分析端粒DNA相关蛋白P28在胸腺及 免疫细胞衰老过程中的生物作用及其与端粒 动力学相关性。5）进一步利用不同基因缺陷小鼠，研究这些 基因在T细胞亚群（Thl7、调节性T细胞等） 分化的可能作用及其调控机制。6）对候选基因进行初步的作用分析。7）利用MAVS、MyD88单基因和双基因剔除小 鼠，初步探讨RLRs和TLRs途径在免疫细
4、胞 发育中的作用以及它们的协同作用机制。8）开展作用缺失和过量表达实验，确定ETS 转录因子在造血干细胞发育分化及迁移中的 作用；并说明其与其它相关主控基因的上位 关系。9）完成中小规模的ENU化学诱变，确定一批 影响胸腺和T细胞发育的重要斑马鱼突变 体。10）预测重要相关蛋白的进化表位；基因克 隆，表达载体构建和重组蛋白的生产方案的 优化。11）获得进化表位的基础数据。克隆相关的 基因并选择不同的表达载体优化表达和纯化 方法。10篇。第1）建立1-2个生物工程技术改造小鼠，确定确定1-2个对胸腺髓质上皮1-2个对胸腺上皮细胞及胸腺细胞分化和作细胞发育和作用具有重要影三用具有重要影响的新作用基
5、因。响的新作用基因。2）较深入研究几个候选基因在胸腺上皮细胞确定造血干细胞在斑马鱼胚年度研究内容预期目标年干细胞及胸腺上皮细胞发育的作用及调控分 子网络。3）完成利用不同基因基因缺陷小鼠，研究这 些基因在T细胞亚群（Thl7、调节性T细胞 等）分化的可能作用及其调控机制。4 ）检测 IL-2Ra-/-IL-17A-/-和 I L-2Ra-/-I L-l 7F-/-双基因敲除小鼠的细胞 亚群，炎性因子的变化及组织病理变化。5）深入探讨RLRs和TLRs两条途径在免疫 细胞发育中的作用以及它们的协同作用机制 6）主要利用敲除、干扰或过量表达等方法初 步分析目的microRNAs在免疫细胞发育过程
6、中的调控作用。7）确定造血干细胞在斑马鱼胚胎时期的起 源、发育分化和迁移路线。8）完成构建较系统的造血干细胞基因调控网 络模式图，并说明ETS转录因子在血液发生、 保持和淋系分化中的分子机制。9）开展定位克隆影响造血干细胞、T淋巴细 胞及胸腺发育的重要突变体/基因。10）运用反向PCR方法完成丙氨酸突变体重 组表达载体的构建，确定相关蛋白的重要作 用位点。胎时期的起源、发育分化和 迁移路线。完成构建较系统的造血干细 胞基因调控网络模式图。明确1-3个对免疫细胞亚群 发育有重要作用的调节通 路。明确1-3个对免疫细胞亚群 发育有重要作用的分子表位 特征及进化特点。在主流杂志上发表论文至少 15篇
7、。年度研究内容预期目标第四年1）建立目的基因缺失小鼠，证实1-2个对胸 腺发育具有重要影响的新作用基因。2）较深入研究候选基因在胸腺上皮细胞干细 胞及胸腺上皮细胞发育、衰老的作用及调控 分子网络。3）初步说明筛选到的影响斑马鱼造血干细 胞、T淋巴细胞及胸腺发育的重要突变体/基 因的分子机制。4）进一步分析目的microRNAs在免疫细胞发 育过程中的调控作用。5）采用Microarray的方法，比拟野生型、 MAVS、MyD88单基因和双基因剔除小鼠的巨噬 细胞的转录表达谱，发现与巨噬细胞表型和作 用重要相关的基因。解析蛋白的作用外表。6）研究目的基因结构与作用之间的关系；利 用建立的实验平台
8、解析相关蛋白质的重要作 用外表特征与位点。证实1-2个对胸腺发育具有 重要影响的新作用基因。确定目的microRNAs在免 疫细胞发育过程中的调控作 用。明确1-3个对免疫细胞亚群 发育有重要作用的调节通 路。理解1-2个目的基因结构与 作用之间的关系。在主流杂志上发表论文至少 15篇。第五年1）应用已建立目的基因缺失小鼠及体外细胞 分析系统，深入研究1-2个对胸腺发育具有 重要影响的作用基因的调控分子网络。2）进行TL-2RaL-174一勺1117三基因敲 除鼠的各种细胞亚群特征变化并研究其发生 机制。3）完成重要调控免疫细胞发育候选基因的分 子调控机制的研究。4）完成目的microRNAs
9、在免疫细胞发育过程 中调控作用机制的研究。解析1-2个对胸腺发育具有 重要影响的作用基因的调控 分子网络。确定新筛选的影响斑马鱼造 血干细胞和T淋巴细胞发育 的重要突变体/基因的分子 机制。完成2-3个与斑马鱼免疫系 统发育相关的哺乳类同源基 因的作用和分子机制。年度研究内容预期目标5）应用动物疾病模型，对目的基因进行深入 研究。6）基于己经确定的蛋白质作用外表设计具有 独特作用的新型分子，为药物先导设计提供 基础，确定设计分子的生物特性。理解2-3个对胸腺及免疫细 胞发育具有重要影响的作用 分子结构与作用之间的关 系。在主流杂志上发表论文至少 15篇。一、研究内容本工程将紧紧抓住“免疫器官及
10、细胞发育分化”主题，重点围绕上述三个基 本科学问题，应用各种遗传修饰的模式动物（斑马鱼、小鼠、果蝇等）及发育生 物学、进化基因组学、分子细胞生物学等理论和技术手段，分以下4个工程深入 开展研究：工程1主要应用斑马鱼、小鼠模型，研究胸腺（胸腺上皮细胞及胸腺 细胞）发育及衰老的关键分子机制，说明胸腺上皮细胞与胸腺细胞相互作用的调 控规律；工程2首先应用斑马鱼报告系统获得对造血干细胞发生、维持和向淋巴 系发育的重要分子，然后应用小鼠模型，深入研究其对干细胞向淋巴细胞发育调 控的分子机制；工程3主要应用果蝇、小鼠及体外免疫细胞诱导体系，研究免疫 细胞向各亚群定向发育分化的调控机制；工程4主要应用进化/
11、比拟基因组学方 法来研究与发现免疫系统发育相关的关键分子，并利用工程1-3提供的技术平台 与体系，进行验证和深入研究。本工程4个工程各有侧重，进行深入研究，又相 互关联与促进；作为一个研究整体，来说明胸腺及造血干细胞向成熟免疫细胞发 育的调控规律及发生机制。二、预期目标应用多种遗传修饰和基因突变模式动物（斑马鱼、小鼠、果蝇等）及进化基 因组学、免疫学、分子细胞生物学、生化等方面技术手段，重点研究免疫器官胸 腺及免疫细胞发育、分化和衰老过程中的重要调控因子及调控机理。通过本工程 的实验研究，解析免疫系统（特别是胸腺及其相关细胞）发育、分化与作用发挥 的关键分子调控线路，揭示免疫系统发育、分化与作
12、用异常与人类健康的关系。 获得一批免疫系统进化、发育、作用相关重要基因和相关蛋白质，说明一些关键 分子的作用，为开发拥有自主知识产权的新型免疫制剂、免疫相关疾病诊断与防 治提供重要理论依据。在理论上有自己独到的创新性见解，在技术上建立一系列 研究免疫发育生物学基础理论的现代生物技术平台和先进技术体系。形成一支具 有国际影响和竞争力的研究团队，培养一批从事相关科学研究的中青年学术带头 人与后备力量。五年预期目标：本工程将建立多种遗传修饰的斑马鱼和小鼠、移植动物模型、体外免疫细胞 发育分化诱导系统、果蝇天然免疫应答遗传筛选系统、免疫系统进化发育生物学 数据库等技术平台，形成一个先进而完整的免疫发育
13、生物学研究体系。揭示胸腺 发育与衰老、造血干细胞形成及其向免疫前体细胞发育分化、免疫细胞定向发育 分化的几个重要分子调控路线，获得一批重要的免疫发育相关的新基因/蛋白质 及细胞亚型，并对其作用和调节机理进行系统研究，形成重要学术假说。力争在 理论上有突破，在技术上有创新。具体指标如下：1 .建立一个先进的免疫发育生物学研究体系与技术平台，包括多种用于研究 免疫系统发育的遗传修饰和基因突变的果蝇、斑马鱼和小鼠，实验方法，技 术手段等。2 .说明调控胸腺上皮细胞干细胞向胸腺上皮细胞发育分化及胸腺上皮细胞与 胸腺细胞发育分化中相互作用的2-3个重要路线。3 .筛选一批参与胸腺和造血干细胞发育、分化、
14、衰老与作用调控的重要基因, 并对其中5-6个关键基因进行调控机理研究，为开展新的免疫药物靶分子和 防治免疫相关疾病提供新思路。4 .解析免疫细胞不同亚群发育分化的1-2个主要分子通路，为有效调控免疫 应答提供重要依据。5 .在国际主流学术杂志上发表论文8090篇，其中IF10的论文12T6篇; 申请国家/国外创造专利5To项。6 .培养博士后15-20名，博士、硕士研究生120名左右。三、研究方案1）学术思路：免疫系统发育与免疫应答是一个极为复杂的生命过程之一。根据目前国际发 展趋势和国内现有研究基础，本工程的总体思路是：应用发育生物学、进化基因 组学、蛋白质组学、系统生物学以及其他最新的理论
15、与技术，凭借各种模式动物 等研究手段与平台，以重要免疫器官胸腺及免疫细胞发育为核心，主要深入探讨 胸腺上皮细胞干细胞向胸腺上皮细胞发育分化的重要调控通路，胸腺上皮细胞与 胸腺细胞发育中相互作用主要机理。同时，围绕胸腺这一免疫器官，我们将进行 淋巴细胞前体细胞及免疫细胞亚群发育调控的实验研究，从而系统理解免疫细胞 发育的整个过程。总之，本工程将在基因进化和作用研究的基础上，通过研究基 因及蛋白质在分子、细胞和整体水平上的相互作用，揭示正常与异常免疫系统发 育过程的调控机理。具体工程设置见下列图（图1）。课题1：胸腺（上皮细胞及胸腺细胞） 发育及衰老的分子机制I 胸腺 ） （上皮细胞、胸腺细胞）I
16、 胸腺 ） （上皮细胞、胸腺细胞）发育相关的重要基因/蛋白质课题3：免疫细胞 亚群定向发育分化 的调控机制胸腺与免疫细胞课题2：造血干细胞 发生、维持和向淋系 发育的分子机制课题4：应用进化/比拟基因组学方法研 究免疫系统发育关键分子回答科学问题：胸腺与免疫细胞发育的重要分子调控机制? 意义：为免疫相关疾病的防治提供重要理论与技术基础。图1.胸腺与免疫细胞发育的分子调控研究工程设置主要科研流程见下列图（图2）。基本问题：免疫系统发育的关键因素与调控机制未知免疫系统发育关键分子免疫系统发育重要基因/蛋白质课题131课题4、课题1-4，遗传修饰和突变果蝇、:一：比拟基因:；斑马鱼研究系统I I组学
17、手段Ij确定免疫系统发育重要基因干细胞胸腺-免疫细胞-亚群发育（上皮细胞、胸腺细胞）课题1-4/遗传修饰、我卜鼠簟，一化段一 J物手-生学 ?:; 胸腺-免疫细胞-亚群发育（上皮细胞、胸腺细胞）回答科学问题疾病发生、开展机制建立免疫系统发育研究平台图2.主要实验流程框架2）技术途径：本工程执行将主要依据已建立和将要建立的模式动物、体外细胞和组织培养模型，通过下述方法或途径分别在几个层次上说明免疫微官（胸腺）和免疫细胞 发生、分化成熟的分子机理。1 .基因水平的研究：应用Northern blot、原位杂交、real-time PCR、CHIP. RNA干扰和过表达、基因报告系统等技术，检测基因
18、在所研究细胞和组织中 的转录表达、定位及调控。2 .蛋白质水平的研究：利用双向电泳、酵母双杂交、免疫共沉淀以及快速定点 突变和结构生物学技术研究蛋白质结构与作用的关系以及蛋白-蛋白相互作 用的分子机制。3 .细胞与组织水平的研究：利用建立的各种细胞和组织培养体系和流式细胞仪、 激光共聚焦显微镜、显微注射等技术，深入研究基因/蛋白质的作用及调控网 络。4 .整体水平的研究：涉及的多种模式动物包括果蝇、斑马鱼、小鼠。通过基因 诱变、转基因动物、基因敲除及转基因干细胞移植等技术建立实验模型，观察靶 基因的作用。5 .免疫分子的进化生物学研究：该研究主要用于筛选人类及相关模式动物的胸 腺及免疫细胞发育
19、分化相关的基因和基因家族，研究其进化起源和作用分化的历 史和动力学过程。3）创新点与特色：立题新颖、前沿:工程十分重视基础理论中的源头创新，对具有应用潜能的研究 将有自主知识产权；以发育生物学的独特视角，研究免疫系统特别是胸腺相关细 胞发育的重要调控分子基础，说明免疫系统发育分化的重要机制及相关疾病的发 病机理，处于当代生命科学研究前沿，具体研究内容国内外均未见详细的报道。 实验模型及研究手段先进：选用的多种研究动物模型,包括条件性或细胞特异性 基因敲除和基因报告技术如（Aire, FoxNl, MAVS, MyD88, PTEN, TLRs等）基 因缺失小鼠，scl:GFP、ragl:GFP
20、. FoxNl:GFP转基因斑马鱼等，着重在体内研 究重要调控基因在胸腺发育、胸腺上皮细胞和淋巴细胞互作中的分子机理。应用 进化基因组学及生物信息学预测及分析相关重要基因及蛋白作用域。实验技术及 分析手段有特色。学科交叉与优势团队:研究团队由不同研究特色和学科研究人员（发育、免疫、 进化等）组成，学科之间交叉明显。同一位研究骨干可参与2个或多个工程研究 内容，各研究组之间将进行密切科研合作，共享实验技术平台和实验模型，将团 队优势挖掘出来，此为本工程的组织特色。4）可行性分析：本研究团队集结了国内在“分子-细胞-组织-动物模型”各层次以及免疫学、 细胞分子生物学及发育生物学等相关领域中具有较好
21、积累和特色实力的研究人 员 参与本工程的学术骨干在Nature Medicine, Proc Natl Acad Sci USA,J Exp Med, Current Biology, Blood, Trends Microbiol, FASEB J, J of Immunology, Hepatology, J of Biological Chemistry, Genome Research, Nucleic Acids Research, Circulation Research, Mechanisms of Development 等国际主流学术杂志上发表 SCI论文200余篇。参与本工
22、程的科学家一直活跃在本领域的科研前沿及积累了 大量前期工作的基础（请见工作基础局部）。我们相信，通过学科交叉、优势互 补、平台共享、协力攻关，在以下几方面取得重大进展是可行的。1）通过FoxNl:GFP转基因斑马鱼报告系统及实验室已建立的其它研究体系，在 发现重要调控胸腺上皮细胞干细胞和其发育的基因及理解其发育机制方面取得 突破的可能性大。2）利用业已建立的髓质区T细胞发育研究体系，探索Aire对胸腺上皮细胞作用 的影响，并揭示Aire缺陷导致胸腺细胞发育异常的机理和病理生理意义。工作 基础坚实、推论合理、研究方案切实可行，取得突破的可能性大。3）工程所需关键造血干细胞及淋巴细胞转基因斑马鱼报
23、告系（scl:GFP、 ragl:GFP）已制备并获得一些初步结果。因此，在确定造血干细胞发生及向淋巴 细胞系发育中重要调控基因方面取得重大突破的可能性大。4）通过酵母双杂交和RNAi技术，已发现一些参与免疫细胞活化的重要因子，因 此在探讨天然免疫细胞成熟及作用分化方面取得突破性进展的可能性大。5）运用进化基因组学分子手段发现新基因作用，以结构和作用进化为导向确立 免疫系统发育关键蛋白/多肽的作用表位方面取得重要进展的可能性大，获得免 疫发育相关药物先导的可能性大。四、年度计划年度研究内容预期目标第年1）建立FoxNl： GFP或RagLGFP绿色荧光转 基因斑马鱼报告系统；应用此系统初步筛选
24、 对胸腺发育起重要作用的局部基因。2）应用生物工程技术改造小鼠、移植动物模 型及细胞分子生物学研究手段，研究候选基 因（如 EP2/4）、Smads、FoxNl 通路、AIRE 等在胸腺上皮细胞干细胞及胸腺上皮细胞发 育的作用及初步调控网络。3）通过基因芯片等分子生化技术，初步筛选 FoxNl在胸腺上皮细胞中作用的下游基因/靶 基因谱。4）初步确定Aire对胸腺髓质上皮细胞分化 和作用的影响并确定其分子机制。5）证实端粒DNA相关蛋白P28在胸腺及免疫 细胞衰老过程中的作用及其与端粒动力学相 关性。6）建立胸腺上皮细胞及其干细胞别离、鉴定 及定量分析的方法技术。7）利用已有的不同基因缺陷小鼠（
25、Smad3, PTEN, IL-2R, MAVS, MyD88, TLRs 等剔除小鼠） 及疾病模型（感染、移植、肝炎等），初步研 究T细胞亚群（Thl7、调节性T细胞等）分化 的重要调节分子及其机制。8） 培 育 出 IL-2Ra-/_TL-17A/_ 和 IL2Ra/lLT7F，的小鼠。9）运用人的cDNA和RNAi文库，通过人的初步确定Aire对胸腺髓质 上皮细胞分化和作用的影响 并确定其分子机制。初步筛选FoxNl在胸腺上皮 细胞中作用的下游基因/靶 基因谱。证实端粒DNA相关蛋白P28 在胸腺及免疫细胞衰老过程 中的作用初步研究免疫细胞亚群（特 别是Thl7、调节性T细胞 等）分化的重要调节分子。 确立三种模式动物免疫发育 相关的候选基因，并完成相 关的进化研究。完成ETS转录因子Fev, Ets2, Gabpa, Elf2,和 Elk4在野生型和三种不同 血细胞突变体斑马鱼 cloche, spadetail 和m）胚胎发育不同时期中 的时空表达图谱。在主流杂志上发表论文至少 6篇。