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1、基因克隆技术在确定药物靶点中的应用关思静中药 1302【摘要】：随着人类基因组计划的完成，基因克隆技术的研究，新技术方法越来越多的用于 药物靶点的发现与确证，为药物设计，生物制药以及用药方案提供了确切的理论依据，对促 进药物发现，药物筛选和药理学研究起到了重要的作用。本文论述了反义核酸技术，RNA 干扰技术，高通量筛选与高内涵筛选，转基因技术等方法在确定药物靶点中的作用。【关键词工分子生物技术 靶点确证 分子药理学药物靶点是指生物体内的一类大分子及其特定结构位点，具有重要的生理 功能，其活性可以通过与药物分子的结合而改变，并产生预期的药理效应。在药 物发现的四个环节中，靶点确证是首要的任务，也
2、是药物发现的关键。随着生命 科学以及生物技术的开展，特别是基因克隆技术的开展，为靶点确证提供了有力 支持1。分子药理学研究的基本理论是受体学说，受体的本质是蛋白质，对于 受体的研究可以说明药物靶点的机制，为靶点确证提供理论依据2。人们对疾 病的认识到达基因水平，对药物作用的认识到达分子水平，而同时新药研究也出 现了新高潮。细胞及分子生物学方法以及基因克隆技术在基因水平上研究受体生 理调节和病理变化的分子机制，受体病的分子基础以及细胞内受体与DNA相互 作用的机制等。分子生物学技术能确定并克隆许多调节蛋白的编码基因，说明调 节蛋白在疾病状态下的变化，从而解释信号转导异常，为靶点确证提供了基础理
3、论与技术支撑。1,高通量筛选与高内涵筛选在药物靶点基因功能研究中的作用高通量筛选：此技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微 板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速仪器采 集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品 检测，并以相应的数据支持整体运转的技术体系。目前HTS广泛应用于发现作用药靶的活性化合物，评价先导化合物的选择性， 毒性等多个药物开发阶段，并在先导化合物的优化等过程中起着重要作用。除与 细胞表形或形态学相关的检测指标外，细胞信号传导通路，糖代谢，能量产生和 代谢产物分析等代谢通路也是基因功能重要的研究内容.结合抗体芯
4、片技术， 多路测定技术等新的检测方法和荧光成像技术，定量PCR,高通量荧光激活细 胞分类器等检测方法和技术的不断开展和应用，灵敏度和重现性这两个高通量筛 选的关键问题也逐步得到解决。高内涵筛选是指在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被筛样 品对细胞形态，生长，分化，迁移，凋亡，代谢途径及信号传导等方面的影响， 在单一实验中获取大量与基因，蛋白质及其他细胞成分相关的信息，确定被筛样 品生物活性和潜在毒性的过程。高内涵筛选应用高分辨率的荧光数码影像系统获 得被筛样品对细胞产生的多维立体和实时快速的生物效应信息，对其多角度分析 的技术。HCS是一种基于细胞层面的、多元的药物筛选方法，它主要依
5、赖于高分辨 率的细胞成像系统，充分整合样品制备技术、自动化设备、数据管理系统，检测试 剂，生物信息学等资源的综合优势，在细胞或分子水平上实现对候选物的多元化、 快速化和规模化筛选。在保持细胞结构和功能完整的条件下，尽可能同时检测被 筛选样品对细胞生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导等多个环节的影 响，涉及的靶点包括细胞的膜受体、胞内成分、细胞器和离子通道等，即从单一试 验中获得大量与候选物药理学活性相关的信息及其潜在毒性作用。与传统的HTS 方法相比，HCS使用单个细胞的形态，结构等多方面的信息来表征细胞的生理 或病理特性，其还能够用于亚细胞群或亚细胞结构方面的研究。2反义核酸技术在药物
6、靶基因功能鉴定中的应用 _反义核酸技术(antisensetechnology)主要包括反义RNA(anlisenseRNA)和反 义寡核甘酸(anti2senseoligonucleotide),通过多种机制快速、可预测地调节培养组 织或细胞的基因表达，从而快速、有效地测定基因功能。反义寡核苜酸主要通过 RNaseH介导的机制抑制基因表达。这种高效的方法已被广泛用于含有反义寡核 甘酸序列样的靶基因的下调(downregulation)。实际上，这种技术对于鉴定mRNA 中的有效靶基因在某种程度上靠经验，因为许多靶基因不能显示最正确活性,是一种 高通量的基因功能检定方法。反义技术广泛用于体内外
7、模型中靶基因功能的验证, 可局部替代基因敲除技术43 RNA干扰技术RNA干扰技术能够有效的介导基因沉默，从而用于靶点确证。通过比拟 正常细胞和RNA干扰介导基因沉默的细胞对药物的反响，可以揭示药物靶点基 因，筛选药物靶点，也可以说明药物作用机制。美国科学家安德鲁菲尔和克雷格梅洛因RNAi此而获得2006年诺贝尔生理 学或医学奖。RNAi为基因和蛋白功能研究、核酸药物的分子设计，药物靶点的发 现、疾病基因治疗等科学研究提供了重要手段。RNAi可以高通量地发现药物靶 基因,从而成为寻找新药作用靶标的有力工具。RNAi可高度特异性地干扰表达潜 在靶点的基因，进而干扰机体疾病的发生与开展，其效果与高
8、特异性靶蛋白的抑制 效果类似。目前,RNAi已广泛用于探索发现治疗肿瘤、病毒感染性疾病、神经退 行性疾病以及血液病等疾病的药物靶标5。siRNA的标记、转染和RNAi的检测 等已广泛用于功能基因组学、基因治疗和转录调控机制研究。4转基因技术在药物作用靶点研究中的应用转基因技术通常包括基因敲入(knockin)和基因敲除(knockout)两种方式，基 因敲入是指利用基因同源重组，将外原有功能基因转入细胞与基因组中的同源序 列进行同源重组，插入到基因组中，在细胞内获得表达的技术。基因敲出是指同 源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，已到达定点修饰 改造染色体上某一基因的目的的一
9、种技术。其显著特点是分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达。转基因技术的出 现为体内研究药物对机体整体的作用提供了很好的技术手段，在药物发现过程中 起重要作用。真核细胞的基因转染(genelransfer)技术是研究基因功能的有效手段 之一。动物的正常生理依赖于体内不同类型细胞间的相互作用，后者通过细胞通 讯和信号转导实现由于一个基因功能的实现不仅会对细胞和整体产生作用，同时 也会受到来自细胞内外的调控，因此，在正常或病理状态下的整体动物中进行基因 功能的评价和确证研究更为有效。5 总结在当代药物开发过程中发现和选择合适的药物靶点是药物开的第一步，也 是药物筛选及药物定向合成的关键因素之一
10、。随着细胞分子生物学技术的飞速发 展，对药物和疾病的认识也都到达了新的高度，基因克隆技术将会在药物发现以 及药物应用方面更加广泛，也会得到更好的开展。参考文献：1唐炳华.分子生物学.北京：中国中医药出版社,2011.52 HanashSM,Madoz2GurpideJ,MisckDE 1 Leukemia,2002,16 (4)： 478485【3】IlagLL,NgJH,BesteG,etaI 1 DrugDiscovToday,2002,7 (18)： 136-142【4】刘明等.细胞分子生物学技术在靶向药物筛选换中的应用.生物技术通 报.2009年第6期5 NovinaCD,MurrayMF,DyKxhoornDM,etallNatMed,2002,8(7):681 6861