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1、微生物代谢产物在溶栓药物中的应用微生物代谢产物在溶栓药物中的应用(1)(1)作者：辜转荣，潘洁，程远方，王蓓【关键词】【关键词】微生物代谢产物;,溶栓药物;,激酶;,纤溶活性随着基础生命科学的发展和各种新的生物技术的应用，由微生物产生的具有除抗感染、抗肿瘤作用以外的其他活性物质的报道日益增多，如酶制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂和氧化剂等，在微生物药物研究之中溶栓药物是近年来的又一大亮点。当前血栓症如急性心肌梗塞(AMI)、静脉血栓塞等已成为严重危害人类健康及生命的心血管疾病，据世界卫生组织调查显示，全世界血塞性疾病患者不少于 1 500 万人1，又以老年人占大多数。心脑血管疾病已跃居人类死因的首
2、位，发展高效特异性溶栓药物是防治心脑血管疾病的重要手段，因此溶栓药物的研究开发也相当活跃。由于微生物生长速度快，生长条件易于控制，产物提取工艺也较简单，因而微生物作为溶栓药物(纤溶活性物质)的重要来源，已越来越受到重视。1 1 微生物在药物研究中的重要地位微生物在药物研究中的重要地位微生物药物是指具有抗微生物作用及其它生理活性的微生物次级代谢产物及其衍生物。1929 年英国细菌学家 A.Fleming 发现了第 1 个有实用意义的抗生素-青霉素，在巨大的医疗效益促进下，各国的微生物学家就掀起了一个广泛寻找土壤中拮抗性微生物的热潮。如 1944 年，美国微生物学家 S.Waks man从近 10
3、4 株土壤放线菌中，找到了疗效显著的链霉素2，而日本科学家梅译滨夫除了发现卡那霉素等多个具有临床应用价值的抗生素外，还提出了酶抑制剂的概念，开创了从微生物次级代谢产物中寻找其它生理活性物质的新时代。所谓微生物次级代谢产物，是指在微生物生命活动过程中产生的极其微量的、对微生物本身的生命活动没有明显作用，而对其它生物体往往具有不同的生理活性作用的一类物质。近 20 年来不断发现和开发成功的非抗菌性的特异性酶抑制剂、免疫调节剂和受体拮抗剂等生理活性物质已经成为当今微生物药物研究与开发的主体。19801999 年微生物代谢活性生理物质的大致分布如表 13。作为微生物药物，其作用对象已不是简单的微生物感
4、染或肿瘤细胞，已经迅速向其它生理活性物质拓宽。表 1 19801999 年新微生物代谢产物活性统计（略）2 2 微生物与溶栓药物的发展微生物与溶栓药物的发展溶栓酶4可来源于人体（如尿激酶(UK)、组织纤溶酶原激活剂(t-PA)等）、动物（如腹蛇抗栓酶、蚓激酶等）、微生物等，其中微生物是溶栓药物的重要来源。从作用机理来讲微生物来源的溶栓药物可分成两类：一类是纤溶酶原激活剂，如链激酶(SK)、葡激酶(SaK)，其作用原理是先将纤溶酶原激活为纤溶酶，而具有丝氨酸蛋白酶活性的纤溶酶则能降解构成血栓骨架的纤维蛋白，从而引起溶栓作用；另一类是纤溶酶类物质，其作用不通过激活纤溶酶原，而是直接降解血块中的纤维
5、蛋白溶解血栓，如来源于芽孢枯草杆菌的纳豆激酶(NK)，以及分别来源于芽孢杆菌、粪链球菌、链酶菌等的纤溶活性物质。目前溶栓药物的发展不仅从自然界中的微生物筛选，更为重要的是通过改造的微生物-基因工程菌，提高了溶栓药物的应用专一性。在国内外，利用微生物寻找溶栓药物依然是最佳手段，因此微生物在溶栓药物的发展过程中起了巨大的促进作用。3 3 微生物代谢产物在溶栓药物制备中的研究微生物代谢产物在溶栓药物制备中的研究3.1 链激酶(streptokinase，SK)59链激酶来源于-溶血链球菌(Streptococcus homo-lyticus)是最早用于临床的溶栓剂，发现于 1949 年，直到 195
6、8 年才开始作为药物，主要用于治疗心肌梗塞，分子量为 4750.2KD。SK 进入血液循环后，必须与纤溶酶原(PLG)以 11 比例结合成 PLG-SK 复合物，复合物中纤溶酶原活化位点通过三维结构的改变暴露在分子表面，这样才能激活纤溶酶原成为有活性的纤溶酶。纤溶酶的作用有两个：其一是迅速降解纤维蛋白原成小分子产物，这些降解产物不能参与血纤维网的形成过程，从而阻碍血栓形成；另一方面纤溶酶可以直接降解纤维蛋白，引起血栓溶解。SK经应用于临床表明，优点是有效、价廉，冠状动脉开通率为 58%，缺点是具有抗原性。由于天然产生的 SK 抗体广为存在，在应用 SK 治疗的过程中，严重的免疫反应时有发生，从
7、而导致出血综合症，另外 SK 半衰期短影响了药效的发挥。为了保证 SK 应用的安全性和有效性，现正有研究者利用杂交瘤技术制备抗 SK 单克隆抗体(mAb)，通过竞争性结合实验，分为 6 个主要的补体组，它们分别与 SK 分子不同区域结合，研究其分子结构与免疫原性之间的关系，且已经应用于临床，产生了一定的效果。3.2 葡激酶(Staphylokinase，SaK)7，10，11葡激酶(Staphylokinase，SaK)是由金黄色葡萄球菌分泌的一种胞外蛋白质，是由四种纤溶酶原激活因子构成的蛋白质家族，四个成员分别是 STAN、STA-CM-I、STA-CN-、STAR-C，它们的分子量均为 1
8、6.5 KD。葡激酶的作用机制与 SK 有相似之处，也是一“间接型”纤溶酶原激活物。它必须先形成无活性的复合物PLG-SaK，继之在机体产生的少量纤溶酶启动下，纤溶酶原活性部位暴露，由单链变为双链的纤溶酶，形成活性 Pli-SaK 复合物，后者进一步激活纤溶酶原分子，使之转变为纤溶酶并进一步溶解血栓。体内实验证明 SaK 有极强的纤维蛋白特异性，这一点与 SK 完全不同。动物血栓模型显示，SaK 溶解富含血小板的动脉血栓并使血管维持再通状态的疗效显著优于 SK，STAR-C 能使更多的栓塞血管畅通，而且所用时间也较短。一期临床试验已经证明，STAR-C 对纤维蛋白原、纤溶酶原、a2 抗纤溶酶没
9、有系统的副作用。当药用剂量达到 30 mg 时，SaK 与 t-PA 有相似的溶栓效果，作用时间可持续 30 min，而且在这一剂量下，无纤维蛋白原的大量降解现象，这是其它无纤维蛋白专一性的激活剂无法达到的效果。虽然迄今为止未见有 SaK 引起过敏反应的报道，但 SaK 来源于细菌，有着潜在的免疫原性，最近科研工作者已尝试用蛋白质工程的手段来降低其免疫原性，并取得了一定的成果。3.3 纳豆激酶(Nattokinase,NK)12，13纳豆激酶是目前研究比较多的新一代溶栓药物，是纳豆在发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus Subtilis)产生的一种丝氨酸蛋白酶。研究表明，纳豆激酶具有纤溶
10、活性，可治疗和预防血栓病，它还可激活体内的纤溶酶原，从而增加内源性纤溶酶的量与作用。众多研究表明纳豆激酶是一个单链多肽酶，由 275 个氨基酸组成，中间无二硫键。分子量为 27.3KD，其 pH 值为 8.60.3，其活性中心催化部位由 Asp32，His64，Ser221 组成，底物结合部位由 Ser125，Leu126，Glu127 组成。动物血栓模型显示，等摩尔的 NK、纤溶酶、弹性蛋白酶的血管再通率分别为（62.05.3%），（15.8 0.7%），10%，无论体外或体内实验，NK 的纤活性都为纤溶酶的 4 倍以上，此外 NK 还可以激活静脉内皮的细胞产生 t-PA，利于溶栓作用的更好发挥。NK 对交联纤维蛋白有很强的水解活性，但对纤维蛋白原却并不敏感。实验证明，NK 的纤维蛋白原水解活性远低于纤溶酶和弹性蛋白酶，甚至尿激酶，而与 t-PA 相同，这提示 NK 在发挥纤溶作用的同时，不水解血浆蛋白原，不易引起出血倾向。基于纳豆激酶是来源于一种食源性的溶栓药物，无任何毒副作用，还具有药效时间长、无免疫原性的特点，因而有很大的开发价值。