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1、欧阳术创编 2021.02.02欧阳美创编 2021.02.02密度梯度离心法分离 PBMC时间：2021.02.02创作：欧阳术1.在15mL离心管中加人5mL淋巴细胞分离液Ficoll。2.取5mL杭凝静瞅血与5mL无菌PBS按照1:1充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，动作一定要轻，注意保持清楚的界面。外周血，PBS,淋巴细胞分离液最终体 枳比为1：1：lo3.水平离心400gx30分绅。（注意：为保证分离效果，需 将离心机升降速率调至最低，即升速为1,降速为0,这样调整 后，升降速会比较慢，总体离心时间约为1小时。）4.离心后可看见管内分为三层，上层为血浆和PBS,T层壬要为
2、红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。在上、中 层界面处有一以单个核细胞为主的白色录雾层获窄带（如下图），单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。欧阳术创编 2021.02.02欧阳美创编 2021.02.02欧阳术创编 2021.02.02欧阳美创编 2021.02.02血浆和PBS W单个核细胞淋巴细胞分离液W红细胞和粒细胞 5.去除部分上层液体（用移液管吸取，不可颐倒），余下 约lmL,用移液器捕到左雾层，吸取单个核细胞。置人另一15mL离心管中，加入5倍以上体枳的PBS,离心300gxl0分 鉀，洗涤细胞两次。6.末次离心后，弃上淸，加人红细胞裂解液，室温辭育2分绅，裂解
3、红细胞，可根据情况适量增减时间。7.加人lOmLPBS,离心300gxl0分鉀，洗涤细胞两次。8.末次离心后，弃上清，加入含有10%FBS的RPMI1640,重悬细胞，廿数，廿算细胞活力。用本法分离PBMC,毎ImL全血可分离得到12X106PBMC,不同人个体之间存在一定差异。活细胞百分率 在95%以上。注意：1.所有操作都应在无菌条件下进行。2.在分离前Ficoll和PBS等试剂均需在37C恒温水浴中预热半 小欧阳术创编 2021.02.02欧阳美创编 2021.02.02欧阳术创编 2021.02.02欧阳美创编 2021.02.02时以上。3吸取单个核细胞时不可避免会吸到Ficoll,而Ficoll密度比细 胞要大，因此步骤5中需加人足量PBS稀释，若PBSIJ枳太 小可能会导致细胞无法离心收集。时间：2021.02.02创作：欧阳术欧阳术创编 2021.02.02欧阳美创编 2021.02.02