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1、各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下，在酶切位点以外多出碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。3 个在资料上查不到的，我们一般都随便加 3 个碱基做保护。寡核苷酸近末端位点的酶切（Cleavage Close to the End of DNA Fragments（oligonucleotides）为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB 采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头 上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近常需在识别位点两端至少加上DNA 末端时也
2、很有用。在本表中没有列出的酶，则通6 个保护碱基，以确保酶切反应的进行。0.1A260单位的寡核苷酸。取 1Q实验方法：用Y32PATP 在 T4 多聚核苷酸激酶的作用下标记已标记了的寡核苷酸与 20 单位的内切酶，在 20 C 条件下分别反应 2 小时和 20 小时。反应缓冲液 含 70 mMTris-HCI（pH 7.6）,10 mM MgCI2,5 mM DTT 及适量的 NaCl 或 KCI（视酶的具体要求而 定）。20%的PAGE（7 M 尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
3、1切割率%1酶寡核苷酸序列链长2 hr20 hr000090909090909090Acc IG GTCGAC CCG GTCGAC CGCCG GTCGAC CGG810128101281012810000090909090905090Afl IIICACATGT GCCACATGT GGCCC ACATGT GGGAsc IGGCGCGCCAGGCGCGCC TTTGGCGCGCC AAnAva ICCCCGGG GCC CCCGGG GGTCC CCCGGG GGA12810128101281012922242788101281012810128101281012810814901090
4、90075250050002525009050909090909090001009090025050902590900909000901005090009050909090909090007509090050075BamH ICGGATCC GCG GGATCC CGCGC GGATCC GCG、Bgl IICAGATCT GGAAGATCT TCGGA AGATCT TCC1BssH IIGGCGCGC CAG GCGCGC CTTTG GCGCGC CAABstE IIBstX IG GGT(A/T)ACC CAACTGCAGAA CCAATGCATTGGAAAACTGCAG CCAATG
5、CATTGG AACTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCATCla ICATCGAT GGATCGAT CCC ATCGAT GGCCC ATCGAT GGGEcoR IG GAATTC CCG GAATTC CGCCG GAATTC CGG厂Hae IIIGG GGCC CCAGC GGCC GCTTTGC GGCC GCAAHind IIICAAGCTT GCC AAGCTT GGCCC AAGCTT GGG1Kpn IGGGTACC CGG GGTACC CCCGG GGTACC CCGMlu IGACGCGT CCGACGCGT CGiNco ICCCATGG GCATG
6、 CCATGG CATGNde ICCATATG GCC CATATG GGCGC CATATG GCGGGGTTT CATATG AAACCCGGAATTC CATATG GAATTCCGGGAATTC CATATG GAATTCCC-8101218202281012121620242812228101281012248142224268101288122830320000757501010010102525109000000075010909000100100500101000009090025500101090909090025900255090010909000251010090050
7、75Nhe IGGCTAGC CCG GCTAGC CGCTAGCTAGC TAGNot ITTGCGGCCGC AAATTT GCGGCCGC TTTAAAATAT GCGGCCGC TATAAAATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTATAAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAANsi ITGC ATGCAT GCACCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTTPac ITTAATTAAGTTAATTAA CCC TTAATTAA GGPme IGTTTAAACGGTTTAAAC CGG GTTTAAAC CCAGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG
8、GCTGCAG CTGCA CTGCAG TGCAAACTGCAG AACCAATGCATTGGAAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAACTGCAG AACCAATGCATTGGATGCATPst IPvu ICCGATCG GATCGATCG ATTCG CGATCG CGALSac ISac IICGAGCTC GGCCGCGG CTCC CCGCGG GGASal IGTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGCGC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGGACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAASca IGAGTAC
9、T CAAAAGTACT TTT81268101281012148121481012810121481012810121410750010901010000010909090090757501010025509025751010509090905050025509090900909090025750759090rSma ICCCGGGCCCCGGG GCC CCCGGG GGTCC CCCGGG GGASpe IGACTAGT CGG ACTAGT CCCGG ACTAGT CCGCTAG ACTAGT CTAGSph IGGCATGC CCAT GCATGC ATGACAT GCATGC A
10、TGTStu IAAGGCCT TGA AGGCCT TCAAAAGGCCT TTTXba ICTCTAGA GGC TCTAGA GCTGC TCTAGA GCACTAG TCTAGA CTAGCCTCGAG GCC CTCGAG GGCCG CTCGAG CGGXho IXma ICCCCGGG GCC CCCGGG GGCCC CCCGGG GGGTCCC CCCGGG GGGA2.双酶切的问题参看目录，选择共同的 buffer。其实，双酶切选哪种 buffer 是实验的结果，takara 公司从 1979 年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切
11、完全是依据具体实验结果得到的。有共同 buffer 的，通常按照常规的酶切体系，在表现出 star 活性，常用 30C单切。两个酶切位点相邻或没有共同切。buffer 的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶37C进行同步酶切。但BamH I 在 37C下有时buffer3.酶切底物 DNA，切不开1）底物 DNA 上没有相应的限制酶识别位点，或酶切位点被甲基化。2）PCR 引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误，致使没有正确的酶切位点存在。PCR 产 物酶切前尽量进行精制以更换 buffer。由于 PCR 产物中带入的其它物质，会影响酶切，据报道，通常 PCR 产物的添加量占
12、总反应体积 25%以下没有问题。3）酶切条件的确认，包括反应温度和反应体系等。同样的 DNA，同样量，用不同的限制酶切情况 可能不同，由于 DNA 的空间结构造成的。同样的 DNA，不同的反应体系，酶切效果也可能不同，由于一些空间因素或不可测因素造成的。4）公司出售的限制酶都是液体状态，都是根据最佳反应体系配制了浓度，不可以再用 buffer 稀释，因为酶浓度和活性之间不呈直线对应关系，酶浓度越稀，相对活性越低，并且越不稳定，有时便会 出现底物 DNA 不能被切断的现象。不同公司的酶和 buffer 不要交叉使用，否则可能会影响酶切效果。5）酶的识别位点上的碱基被甲基化。可以选用不受甲基化影响
13、的同裂酶，或将质粒 DNA 转入甲基 化酶欠损的宿主菌中，重新制备 DNA，也可以使用 PCR 的方法对 DNA 进行扩增，再做酶切。常用 的有 XbaI 容易受甲基化影响，通常选用 GM33 做宿主菌转化。6）底物不纯，含有限制酶阻害物质，影响酶切作用，需要重新纯化 DNA。一般做乙醇沉淀纯化即 可。如果质粒中含盐或酚等，都会影响酶切效果。4.DNA 经酶切后，电泳无带或出现 smear 现象DNA 或酶切试剂中混有 DNase，在一定的温度或缓冲液的作用下，激发 DNase 的作用，将 DNA 降解。可以用 DNA 上的其他酶，也可以用此酶切其他 DNA 来检查问题所在。如果质粒酶切出现此 情况，首先将质粒做乙醇沉淀再酶切。5.甲基化酶M.Alu I,M.Bam H I,M.RcoR I 不属于 CG 甲基化，dam 甲基化，也不属于 dcm 甲基化。甲基化酶作用后，DNA 不能被相应的酶切断。