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1、.病毒的血凝及血凝抑制试验病毒的血凝及血凝抑制试验有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI 试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。目的要求目的要求 掌握病毒 HA 和 HI 试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。材料与试剂材料与试剂 1.96 孔“U”形或“V”形微量反应板，50L 定量移液器，滴头，微型振荡器。2.生理
2、盐水，0.5%鸡红细胞悬液。3.新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。实验内容及操作方法实验内容及操作方法 （一）血球凝集（一）血球凝集(HA)(HA)试验试验1.在 96 孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50L 生理盐水。2.于左侧第 1 孔加 50L 病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸 50L至第 2 孔，依次倍比稀释至第11 孔，吸弃 50L；第 12 孔为红细胞对照。3.自右至左依次向各孔加入0.5%鸡红细胞悬液 50L，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果（表4-1）。表表 4-1 4-1病毒血凝试验的操作方法（单位：病毒血凝试验的操作方法（单位
3、：L L）孔 号病毒稀释度生理盐水病毒液11:25521:431:84567891011121:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048对照550550505050弃 500.5%红细胞5结果观察+-4.结果判定：从静置后10 min 开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行.结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100%凝集（+），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。以 100%凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则 l:128 为 1 个血凝单位，1:64、l:32 分别
4、为 2、4 个血凝单位，或将128/4=32，即 1:32 稀释的病毒液为 4 个血凝单位。(二二)血球凝集抑制血球凝集抑制(HI)(HI)试验试验1.根据 HA 试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4 个血凝单位的病毒液。2.在 96 孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1 孔至第 11孔各加 50L 生理盐水。3.第孔加被检鸡血清50L，吹吸混合均匀，吸50L 至第 2 孔，依此倍比稀释至第 10 孔，吸弃 50L，稀释度分别为：1:、1:4、1:8 ；第 12 孔加新城疫阳性血清 50L，作为血清对照。4.自第 1 孔至 12 孔各加 50L 4 个血凝单位的新城疫病毒液，其
5、中第11 孔为 4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min。5.自第 l 孔至 12 孔各加 0.5%鸡红细胞悬液 50L，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果（表 4-2）。表表 4-24-2病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：L L）孔号血清稀释度生理盐水被检鸡血清4 单位病毒室温中静置 10 min0.5%红细胞弃去50结果观察-+-5511:255521:434567891011病毒对照5012血清对照501:81:161:321:641:1281:2561:5121:1024505055050505050506.结果判定：待病毒对照孔（
6、第11 孔）出现红细胞 100%凝集（+），而血清对照孔（第 12 孔）为完全不凝集（-）时，即可进行结果观察。以 100抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效.价，即 HI 效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。从表 4-2 看出，该血清的 HI 效价为 1:64，用以 2 为底的负对数(-log2)表示，即6log2。附附录录1.阿氏液（Alsever）：即红细胞保养液枸橼酸钠（5H2O）0.80g枸橼酸（H2O）0.055g葡萄糖 2.05g氯化钠 0.42g双蒸水加至 100 ml将以上试剂加热溶解于双蒸水中，调整pH 至 6.8，115灭菌 10min,4 保存备用。2.0.5%鸡红细胞制备方法先用灭菌注射器吸取3.8%枸橼酸钠溶液(其量为所需血量的15)，从鸡翅静脉或心脏采血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水为抗凝血的2 倍，以2000r/min 离心 10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据所需用量，用灭菌生理盐水配成0.5%鸡红细胞悬液。3.96 孔微量反应板的清洗将浸泡有75%乙醇的棉签放入微量反应板的每个孔内旋转，用自来水冲洗反应板 5 次，再用蒸馏水冲洗3 次以上，置 37温箱中干燥。.