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1、会计学1禽病病原之实验室检测禽病病原之实验室检测(jin c)方法方法20140425第一页，共96页。成成立立于于20112011年年，是是集集动动物物疫疫病病诊诊断断、研研究究和和服服务务为为一一体体的的技技术服务窗口。术服务窗口。通通过过检检测测服服务务，对对畜畜禽禽健健康康水水平平和和疫疫病病状状态态进进行行全全面面科科学学系系统统的的分分析析评评估估，指指导导养养殖殖客客户户做做好好科科学学防防疫疫和和用用药药工工作作，建建立立推推广广“免免疫疫+用用药药+监监测测+净净化化+生生物物安安全全管管理理”的的全全新新方案方案(fng n)(fng n)式兽医服务模式。式兽医服务模式。第
2、1页/共96页第二页，共96页。n n与宾夕法尼亚州立兽医诊断中心联合成立与宾夕法尼亚州立兽医诊断中心联合成立“中美动物中美动物(dngw)(dngw)诊断服务中心诊断服务中心”，与，与“中国科学院海洋研究所、中国农业科学院兰州兽医研究所、中国农中国科学院海洋研究所、中国农业科学院兰州兽医研究所、中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所、国家生化工程技术研究中心（上海）和国业科学院兰州畜牧与兽药研究所、国家生化工程技术研究中心（上海）和国家兽用生物制品工程技术研究中心等家兽用生物制品工程技术研究中心等5 5家单位签约形成战略合作。实现了技术家单位签约形成战略合作。实现了技术服务升级；积极探索、实施与
3、规模化养殖企业建立服务升级；积极探索、实施与规模化养殖企业建立“战略合作战略合作”，实现，实现“产产业链共赢业链共赢”。第2页/共96页第三页，共96页。第3页/共96页第四页，共96页。第4页/共96页第五页，共96页。瑞普技术瑞普技术(jsh)(jsh)服务体系服务体系n n四大服务中心四大服务中心n n1 1名研究员名研究员n n4 4名博士名博士n n1515名硕士名硕士(shush)(shush)n n2020名养殖专家名养殖专家n n100100多名技术员多名技术员第5页/共96页第六页，共96页。诊断/监测聚焦聚焦三大核心功能三大核心功能三大核心功能三大核心功能 研究 服务疾病诊
4、断研究疾病诊断研究(ynji)(ynji)中心中心第6页/共96页第七页，共96页。5个业务室个业务室1个综合个综合(zngh)管理室管理室禽病毒检测室：禽病毒检测室：猪病毒检测室：猪病毒检测室：血清学检测室：血清学检测室：细菌学检测室：细菌学检测室：诊断试剂诊断试剂(shj)开发开发室：室：样品接收样品接收(jishu)与登与登记记检测任务下达检测任务下达检测报告的复核与递送检测报告的复核与递送客户沟通与结果分析客户沟通与结果分析菌毒种归档与保藏菌毒种归档与保藏实验室和物料平衡管理实验室和物料平衡管理 动物动物疾病疾病诊断研究服务中心诊断研究服务中心疾病诊断研究中心疾病诊断研究中心疾病诊断研
5、究中心疾病诊断研究中心第7页/共96页第八页，共96页。四大四大四大四大(s d)(s d)(s d)(s d)特点特点特点特点n n专业：人员、场所专业：人员、场所专业：人员、场所专业：人员、场所(chn su)(chn su)(chn su)(chn su)、试剂、试剂、试剂、试剂n n全面：禽全面：禽全面：禽全面：禽16161616项；猪项；猪项；猪项；猪13131313项，细菌项，细菌项，细菌项，细菌12121212项项项项n n规范：有标准可依规范：有标准可依规范：有标准可依规范：有标准可依n n研究：集团化客户的专题合作研究研究：集团化客户的专题合作研究研究：集团化客户的专题合作研
6、究研究：集团化客户的专题合作研究第8页/共96页第九页，共96页。先进先进先进先进(xinjn)(xinjn)(xinjn)(xinjn)的仪器设备的仪器设备的仪器设备的仪器设备第9页/共96页第十页，共96页。先进先进先进先进(xinjn)(xinjn)(xinjn)(xinjn)的仪器设备的仪器设备的仪器设备的仪器设备第10页/共96页第十一页，共96页。先进先进先进先进(xinjn)(xinjn)(xinjn)(xinjn)的仪器设备的仪器设备的仪器设备的仪器设备第11页/共96页第十二页，共96页。先进先进(xinjn)(xinjn)的仪器设备的仪器设备第12页/共96页第十三页，共9
7、6页。先进先进(xinjn)(xinjn)的仪器设备的仪器设备第13页/共96页第十四页，共96页。先进先进(xinjn)(xinjn)的仪器设备的仪器设备第14页/共96页第十五页，共96页。先进先进(xinjn)(xinjn)的设备的设备第15页/共96页第十六页，共96页。第16页/共96页第十七页，共96页。第17页/共96页第十八页，共96页。标准标准标准标准(biozhn)(biozhn)(biozhn)(biozhn)的操作程序的操作程序的操作程序的操作程序第18页/共96页第十九页，共96页。定点定人定性定量定期养殖场定性(dng xng)检测抓住源头合理(hl)定点系统监测专
8、人服务(fw)专家咨询固定数量全面监测固定周期持续监测五定监测机制五定监测机制五定监测机制五定监测机制 第19页/共96页第二十页，共96页。血清学血清学生化生化组织病组织病理切片理切片药理学药理学快速诊断快速诊断基因分析基因分析区分野毒与疫苗毒区分野毒与疫苗毒病源分离与鉴定病源分离与鉴定耐药性分析耐药性分析抗原性分析抗原性分析环境监测环境监测环境监测环境监测毒物分析毒物分析病原鉴定病原鉴定病理变化病理变化确诊疾病确诊疾病制定方案制定方案监测免疫效果监测免疫效果野毒感染状况野毒感染状况筛选优质药物筛选优质药物分子微分子微生物学生物学微生物微生物学学诊断诊断诊断诊断研究研究研究研究六大六大(li
9、 d)(li d)监测技术监测技术第20页/共96页第二十一页，共96页。实验室诊断：确诊疾病实验室诊断：确诊疾病实验室诊断：确诊疾病实验室诊断：确诊疾病(jbng)(jbng)，制定防控方案，制定防控方案，制定防控方案，制定防控方案 流行病学调查：掌握不同地区、不同季节流行病学调查：掌握不同地区、不同季节流行病学调查：掌握不同地区、不同季节流行病学调查：掌握不同地区、不同季节(jji)(jji)疾病流行动态，事先预防疾病流行动态，事先预防疾病流行动态，事先预防疾病流行动态，事先预防 病源基因进化分析研究：掌握病源分子生物学变化情况病源基因进化分析研究：掌握病源分子生物学变化情况病源基因进化分
10、析研究：掌握病源分子生物学变化情况病源基因进化分析研究：掌握病源分子生物学变化情况(qngkung)(qngkung)，筛选疫苗毒株，筛选疫苗毒株，筛选疫苗毒株，筛选疫苗毒株 细菌的耐药性分析：筛选特效药物，优化用药方案细菌的耐药性分析：筛选特效药物，优化用药方案细菌的耐药性分析：筛选特效药物，优化用药方案细菌的耐药性分析：筛选特效药物，优化用药方案 环境监控：改善饲养环境、评价生物安全体系环境监控：改善饲养环境、评价生物安全体系环境监控：改善饲养环境、评价生物安全体系环境监控：改善饲养环境、评价生物安全体系 血清监测：血清监测：血清监测：血清监测：评价评价评价评价免疫免疫免疫免疫状态状态状态
11、状态、评价、评价、评价、评价疫苗效果、确定免疫程序、诊断、控制净化疫苗效果、确定免疫程序、诊断、控制净化疫苗效果、确定免疫程序、诊断、控制净化疫苗效果、确定免疫程序、诊断、控制净化 病源研究：研究病源抗原性变化，制备病源研究：研究病源抗原性变化，制备病源研究：研究病源抗原性变化，制备病源研究：研究病源抗原性变化，制备“适应性适应性适应性适应性”疫苗疫苗疫苗疫苗七项服务内容七项服务内容七项服务内容七项服务内容第21页/共96页第二十二页，共96页。N O.1病原检测意义N O.2病原采集与检测流程N O.3PCR快速检测法N O.4病毒分离法第22页/共96页第二十三页，共96页。4月月9日晚间
12、消息，国内民营日晚间消息，国内民营(mn yn)预防医疗服务提供机构爱康预防医疗服务提供机构爱康国宾正式在纳斯达克挂牌上市。成为国内首家健康体检赴美国宾正式在纳斯达克挂牌上市。成为国内首家健康体检赴美IPO上市企业。上市企业。第23页/共96页第二十四页，共96页。健康养殖健康养殖(yngzh)的现状的现状n n食品安全；n n养殖及生物安全；n n疫病的多样化、复杂化、混合感染等；n n药物的严格合理使用及残留；n n规模放大(fngd)的瓶颈；第24页/共96页第二十五页，共96页。病原病原(bngyun)的多方面威胁的多方面威胁n n病毒扩散：禽流感、新城疫己进入全球生态系统，由于防控措
13、施中的某些漏洞，致使病毒扩散：禽流感、新城疫己进入全球生态系统，由于防控措施中的某些漏洞，致使病原更广泛的扩散。病原更广泛的扩散。n n免疫抑制：传染性囊病、马立克氏病、鸡传染性贫血、免疫抑制：传染性囊病、马立克氏病、鸡传染性贫血、J J亚型淋巴白血病、网状内皮组亚型淋巴白血病、网状内皮组织增生症、呼肠孤病毒病等的发生，造成织增生症、呼肠孤病毒病等的发生，造成(zo chn)(zo chn)免疫抑制，降低鸡体免疫力，免疫抑制，降低鸡体免疫力，更易被细菌、支原体感染。更易被细菌、支原体感染。n n种代净化：种禽企业对经胚传播疾病净化措施重视不够。必须强化对种鸡的沙门菌、种代净化：种禽企业对经胚传
14、播疾病净化措施重视不够。必须强化对种鸡的沙门菌、支原体、禽白血病、网状内皮组织增生症病毒、呼肠孤病毒的净化工作，以保证养禽支原体、禽白血病、网状内皮组织增生症病毒、呼肠孤病毒的净化工作，以保证养禽业的健康发展。业的健康发展。第25页/共96页第二十六页，共96页。禽病病原检测禽病病原检测(jin c)内容内容n n确定禽病病原，对鸡群疫病防控做到有的放矢；确定禽病病原，对鸡群疫病防控做到有的放矢；n n监测隐性感染，了解监测隐性感染，了解(lioji)(lioji)鸡群健康状况；鸡群健康状况；n n总结疫病流行，为免疫毒株选择提供参考数据；总结疫病流行，为免疫毒株选择提供参考数据；n n进行疫
15、病净化，为实现种禽健康养殖提供可行性方法进行疫病净化，为实现种禽健康养殖提供可行性方法n n分离流行毒株，为制备自制抗原和自家疫苗提供种毒材料分离流行毒株，为制备自制抗原和自家疫苗提供种毒材料n n基因测序比对，建立养殖集团病毒基因数据库基因测序比对，建立养殖集团病毒基因数据库第26页/共96页第二十七页，共96页。病原检测病原检测(jin c)流程流程检测样品的接收和初步分析 鸡胚法分离病毒 RT-PCR鉴定HA确定血凝性；HI确定ND、AI 初步确定病原 出具PCR检测报告确定病原种类 出具完整检测报告 组织 尿囊液 进一步的测序工作第27页/共96页第二十八页，共96页。样品的采集样品的
16、采集(cij)与运输与运输第28页/共96页第二十九页，共96页。正确正确(zhngqu)采样的重要性采样的重要性第29页/共96页第三十页，共96页。以以IBV为例为例n nIBIB根据临床上病变类型主要分为：呼吸道型、肾型。目前流行发根据临床上病变类型主要分为：呼吸道型、肾型。目前流行发病以肾型发生最为普遍。病以肾型发生最为普遍。n n呼吸道出现呼吸困难，有啰音或喘鸣音，雏鸡感染可引起死亡。呼吸道出现呼吸困难，有啰音或喘鸣音，雏鸡感染可引起死亡。n n青年鸡和产蛋鸡感染后可引起产蛋鸡停产或产蛋下降，产软壳蛋、青年鸡和产蛋鸡感染后可引起产蛋鸡停产或产蛋下降，产软壳蛋、沙壳蛋或畸形蛋，蛋清稀薄
17、如水。沙壳蛋或畸形蛋，蛋清稀薄如水。n n病鸡排白色稀粪，脱水，肾脏肿大，花斑肾，死亡率高。病鸡排白色稀粪，脱水，肾脏肿大，花斑肾，死亡率高。n n符合上述临床症状之一者可以怀疑感染鸡传染性支气管炎病毒符合上述临床症状之一者可以怀疑感染鸡传染性支气管炎病毒(bngd)(bngd)，确诊需经实验室检验。，确诊需经实验室检验。1.临床(ln chun)诊断第30页/共96页第三十一页，共96页。第31页/共96页第三十二页，共96页。采样采样(ci yn)工具工具2.无菌、安全(nqun)采样第32页/共96页第三十三页，共96页。IBV病料采集病料采集(cij)n n急性呼吸道型的病鸡，应采取气
18、管渗出物；对于刚扑杀的病鸡急性呼吸道型的病鸡，应采取气管渗出物；对于刚扑杀的病鸡则采取支气管和肺组织。则采取支气管和肺组织。n n肾型和产蛋下降肾型和产蛋下降(xijing)(xijing)的病鸡，应采取病鸡的肾脏和输卵的病鸡，应采取病鸡的肾脏和输卵管。管。n n也可从大肠，尤其是盲肠扁桃体或粪便分离病毒，但从消化道也可从大肠，尤其是盲肠扁桃体或粪便分离病毒，但从消化道分离到的病毒未必与现流行株或发生的病毒有直接关系。分离到的病毒未必与现流行株或发生的病毒有直接关系。3.适时(shsh)采样4.合理、典型采样第33页/共96页第三十四页，共96页。IBV病料采集病料采集(cij)样品量：要足量
19、，且有备份(bi fn)量 血清：至少0.5ml 组织：2-3g 棉拭子：旋转2-3次，且停留3-5s5.适量(shling)采样第34页/共96页第三十五页，共96页。咽喉、腭裂、泄殖腔棉拭子采集方法如下：取咽喉拭子时将拭咽喉、腭裂、泄殖腔棉拭子采集方法如下：取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回子深入喉头口及上颚裂来回(lihu)刮刮35次取咽喉分泌液；取次取咽喉分泌液；取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔并沾取少量粪便。将棉拭子浸入泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔并沾取少量粪便。将棉拭子浸入分装有生理盐水的离心管，折断超出部分，盖紧，并送实验室检分装有生理盐水的离心管，折断超出部分，盖紧，并送实
20、验室检测。测。第35页/共96页第三十六页，共96页。组织组织(zzh)(zzh)样品的保样品的保存存采集样品用封口袋包装，做好采集样品用封口袋包装，做好标记（编号、栋舍、场名），标记（编号、栋舍、场名），避免产生对检测的信息干扰。避免产生对检测的信息干扰。病毒病毒(bngd)检验样品，若检验样品，若24小时内要送到实验室，可冰袋小时内要送到实验室，可冰袋冷藏处理。若超过冷藏处理。若超过24小时的应小时的应冻结处理。冻结处理。夏天不建议送检全鸡检测。夏天不建议送检全鸡检测。第36页/共96页第三十七页，共96页。最终最终(zu zhn)原则就是选择较厚的泡沫盒，同时多放原则就是选择较厚的泡沫盒
21、，同时多放冰块。冰块。病料的包装病料的包装(bozhung)第37页/共96页第三十八页，共96页。病料检测病料检测(jin c)前处理前处理n n将将病病料料放放在在含含有有10000IU/mL10000IU/mL青青霉霉素素和和10mg/mL10mg/mL链链霉霉素素的的pHpH值为值为7.47.4的的PBSPBS内，置于冰盒内送往实验室。内，置于冰盒内送往实验室。n n将将病病料料磨磨碎碎，加加含含抗抗菌菌素素的的PBSPBS制制成成1:51:5体体积积比比组组织织悬悬液液，反反复复冻冻融融，以以3000g3000g离离心心2020分分钟钟，取取上上清清液液，加加入入浓浓度度为为1000
22、IU/mL1000IU/mL的的青青霉霉素素和和终终浓浓度度为为1mg/mL1mg/mL的的链链霉霉素素，3737作作用用(zuyng)1(zuyng)1小小时时后后用用于于PCRPCR检检测测或或鸡鸡胚接种胚接种第38页/共96页第三十九页，共96页。疾病名称疾病名称病料采集部位病料采集部位鸡新城疫（ND）脑组织、气管、肺脏、咽喉拭子禽流感（AI）气管、肺脏、输卵管、咽喉、泄殖腔拭子鸡传染性支气管炎（IB）气管、肺脏、肾脏、咽喉拭子鸡传染性喉气管炎（AILT）气管渗出物、气管、肺禽滑液囊支原体（MS）血液、关节禽败血支原体（MG）血液、气管、肺产蛋下降综合征（EDS）输卵管、畸形蛋、变形卵泡
23、包涵体肝炎（IBH）肝脏、肾脏第39页/共96页第四十页，共96页。疾病名称疾病名称病料采集部位病料采集部位鸡马立克病（MD）肿瘤组织、毛囊、全血禽白血病（ALV）种蛋、胎粪、泄殖腔拭子、肿瘤组织禽脑脊髓炎（AE）发病鸡的脑组织鸡病毒性关节炎（REO）关节及渗出物、腱鞘传染性法氏囊病（IBD）法氏囊、肾脏鸡传染性贫血病（CIA）脾脏、胸腺、法氏囊、骨髓禽网状内皮组织增殖病（RE）全血、脾脏、胸腺、法氏囊、肿瘤组织鸭瘟（DP）全血、鼻咽分泌物、粪便、病变组织鸭病毒性肝炎（DVH）全血、肝脏第40页/共96页第四十一页，共96页。小结小结(xioji)n n根根据据鸡鸡群群发发病病日日龄龄、发发病
24、病时时间间、采采食食情情况况、死死淘淘情情况况、产产蛋蛋情情况况、鸡鸡舍舍环环境境变变化化、外外界界气气候候变变化化等等信信息息，再再依依据据临临床床表表现现、流流行行病病学学、大大体体剖剖检检病病理理变变化化等等对对鸡鸡病病做做初初步步诊诊断断，采采集集相相应应样样品品；无无法判断，则需要多部位法判断，则需要多部位(bwi)(bwi)采集；采集；n n保证采集样本数量；保证采集样本数量；n n无菌处理、方法科学；无菌处理、方法科学；n n记录、保温、密封；记录、保温、密封；第41页/共96页第四十二页，共96页。PCR检测检测(jin c)技术技术第42页/共96页第四十三页，共96页。PC
25、R技术技术(jsh)n nPCR PCR：Polymerase Polymerase chain chain reactionreaction，即即聚聚合合酶酶链链反反应应，是是通通过过模模拟拟体体内内DNADNA复复制制的的方方式式，在在体体外外选选择择性性地地将将DNADNA某某个个特特殊殊区区域域扩扩增增出来的技术。出来的技术。n n19831983，由美国科学家，由美国科学家Kary MullisKary Mullis首次提出。首次提出。n nPCRPCR的的基基本本工工作作原原理理就就是是(jish)(jish)以以拟拟扩扩增增的的DNADNA分分子子为为模模板板，以以一一对对分分别
26、别与与模模板板互互补补的的寡寡核核苷苷酸酸片片段段为为引引物物，在在DNADNA聚聚合合酶酶的的作作用用下下，按按照照半半保保留留复复制制的的机机理理沿沿着着模板链延伸直至完成新的模板链延伸直至完成新的DNADNA合成。合成。第43页/共96页第四十四页，共96页。PCR原理原理(yunl)n nPCRPCR反应的基本成分包括反应的基本成分包括5 5种基本成分：模板种基本成分：模板DNADNA、特异性引物、热稳定、特异性引物、热稳定(wndng)DNA(wndng)DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTPsdNTPs）、）、Mg2+Mg2+。第44页/共96页第四十五页，
27、共96页。第45页/共96页第四十六页，共96页。2023/2/747第46页/共96页第四十七页，共96页。以以IBV为例为例n n组组织织样样品品的的处处理理：肺肺脏脏或或肾肾脏脏等等组组织织样样品品中中加加灭灭菌菌的的0.85%0.85%生生理理盐盐水水研研磨磨成成5 5倍倍1010倍倍的的悬悬浮浮液液，反反复复冻冻融融2 2次次3 3次次后后，以以4000g4000g离离心心(lxn)10min(lxn)10min，取取上上清清液液作作核核酸抽提用。酸抽提用。n n棉棉拭拭子子的的处处理理：将将棉棉拭拭子子充充分分捻捻动动拧拧干干后后除除去去拭拭子子，0.5mL0.5mL样样品品液液经
28、经4000g4000g离离心心(lxn)10min(lxn)10min，取上清液作核酸抽提用。，取上清液作核酸抽提用。n n细细胞胞培培养养物物：取取1mL1mL细细胞胞培培养养物物反反复复冻冻融融2 2次次3 3次次后后，以以4000g4000g离离心心(lxn)10min(lxn)10min后取上清液作核酸抽提用。后取上清液作核酸抽提用。第47页/共96页第四十八页，共96页。抽提抽提IBV RNAn n取取200uL200uL病病料料研研磨磨液液中中的的上上清清液液或或尿尿囊囊液液置置于于一一灭灭菌菌(mi(mi jn)jn)的的2mL2mL离离心心管管中中，同同时时设设立立阴阴性性尿尿
29、囊囊液液或或阴阴性性细细胞胞培培养养液液和和传传染染性性支支气气管管炎炎病病毒毒M41M41株株阳阳性性病病毒毒液液作作为为阳阳性性对对照照，再再分分别别加加入入裂裂解解液液1mlTrizol1mlTrizol，剧剧烈烈混混合合样样品品15s15s，室温放置，室温放置10min10min。n n加加入入200uL200uL三三氯氯甲甲烷烷，颠颠倒倒离离心心管管混混合合5 5次次，室室温温静静置置10min10min，4 4下下10000g10000g离心离心15min15min。第48页/共96页第四十九页，共96页。抽提抽提IBV RNAn n吸吸取取约约500uL500uL上上层层液液至至
30、新新的的无无菌菌离离心心管管中中，加加入入500uL500uL异异丙丙醇醇/无无水水乙乙醇醇，颠颠倒倒混混匀匀，4 4放放置置10min10min，4 4下下以以10000g10000g离心离心15min15min。n n小小心心弃弃去去全全部部上上清清液液，加加入入1mL1mL无无RNaseRNase水水配配置置的的75%75%乙乙醇醇溶溶液液，上上下下轻轻缓缓(qn(qn huhu n)n)颠颠倒倒2 2次次，4 4下下以以7500g7500g离离心心5min5min。n n弃弃去去全全部部上上清清（用用移移液液器器吸吸取取或或者者用用吸吸水水纸纸吸吸干干），风风干干5 510min10m
31、in，即制得，即制得RNARNA。第49页/共96页第五十页，共96页。提取提取(tq)RNA时需要注意的问时需要注意的问题题n n经经常常更更换换新新手手套套和和头头套套，皮皮肤肤上上常常带带有有的的汗汗水水、细细菌、唾液以及空气中的灰尘都有大量菌、唾液以及空气中的灰尘都有大量RNaseRNase。n n使用无菌无使用无菌无RNaseRNase的塑料制品避免交叉污染。的塑料制品避免交叉污染。n n玻玻璃璃器器皿皿可可在在150150烘烘烤烤4 4小小时时，塑塑料料制制品品可可在在0.5M 0.5M NaOHNaOH中中浸浸泡泡1010分分钟钟，然然后后用用水水彻彻底底清清洗洗，高高压压灭灭菌
32、，即可去除菌，即可去除RNaseRNase。n n配配制制溶溶液液应应使使用用无无RNaseRNase的的水水（将将水水加加入入(jir)(jir)处处理理过过不不含含RNaseRNase的的玻玻璃璃瓶瓶中中，加加入入(jir)DEPC(jir)DEPC至至 终终 浓浓 度度 0.01v/v,0.01v/v,放放 置置 过过 夜夜,高高 压压 灭灭 菌菌。注注：DEPCDEPC有致癌之嫌，需小心操作。）有致癌之嫌，需小心操作。）第50页/共96页第五十一页，共96页。RT-PCR反应反应(fnyng)（40ul体系）体系）组份组份加入体积（加入体积（L）5 M-MLV Buffer4dNTP
33、Mixture3Random Primer1M-MLV反转录酶0.4RNase inhibitor0.4RNA10-24RNase-free water补至40程序程序(chngx)：30 10 min；42 1 h；72 15 min；冷却至；冷却至4；-20保存。保存。第51页/共96页第五十二页，共96页。n n设立设立(shl)(shl)以以IBV M41IBV M41株的株的cDNAcDNA为模板的阳性为模板的阳性IBV IBV 病毒对照和阴性尿囊液或阴性细胞培养物的病毒对照和阴性尿囊液或阴性细胞培养物的cDNAcDNA为为模板的阴性对照。模板的阴性对照。第52页/共96页第五十三页
34、，共96页。PCR材料材料(cilio)与程序与程序第53页/共96页第五十四页，共96页。PCR的反应的反应(fnyng)体系体系组份组份加入体积（加入体积（L）ddH2O13.210 PCR Buffer2.0dNTP Mixture1.6Primer.F0.5Primer.R0.5rTaq DNA酶酶0.2cDNA模板模板2.0Total2095预变性5 min；94 40 s；53 40s；72 50共30个循环；72延伸(ynshn)10min，4终止反应。第54页/共96页第五十五页，共96页。PCR检测检测(jin c)中的常见问题中的常见问题 RNARNA酶的污染酶的污染 内内
35、源源的的RNARNA酶酶：进进行行组组织织裂裂解解(li ji)(li ji)时加入时加入RNARNA酶抑制剂酶抑制剂 外外部部环环境境的的RNARNA酶酶：带带一一次次性性手手套套和和口口罩罩，所所有有试试剂剂和和仪仪器器都都必必须须经经过过消消毒毒处处理理和和RNARNA酶酶抑抑制制剂处理剂处理 EBEB的的问问题题，替替代代物物GoldviewGoldview或或Gel-redGel-red第55页/共96页第五十六页，共96页。PCR产物产物(chnw)的凝胶电泳和的凝胶电泳和回收回收n nPCRPCR产物经过产物经过1%1%的琼脂糖凝胶电泳，的琼脂糖凝胶电泳，100V100V，45m
36、in45minn n将电泳结束的胶板置于紫外拍摄仪中观察将电泳结束的胶板置于紫外拍摄仪中观察PCRPCR结果结果n n将目的将目的(md)(md)条带用刀片切下，用凝胶回收试剂盒进行回收条带用刀片切下，用凝胶回收试剂盒进行回收n n回收的目的回收的目的(md)(md)条带直接送测序公司测序条带直接送测序公司测序第56页/共96页第五十七页，共96页。IBV凝胶成像凝胶成像第57页/共96页第五十八页，共96页。PCR检测检测(jin c)中的常见问题中的常见问题结果出现结果出现结果出现结果出现(chxin)(chxin)(chxin)(chxin)假阳性假阳性假阳性假阳性目标序列太短或者引物序
37、列太短，导致出现目标序列太短或者引物序列太短，导致出现目标序列太短或者引物序列太短，导致出现目标序列太短或者引物序列太短，导致出现(chxin)(chxin)(chxin)(chxin)假阳性；需要重新设计引物假阳性；需要重新设计引物假阳性；需要重新设计引物假阳性；需要重新设计引物靶序列或扩增产物交叉污染；加样时要小心，阳性对照应最后加或者通过巢氏靶序列或扩增产物交叉污染；加样时要小心，阳性对照应最后加或者通过巢氏靶序列或扩增产物交叉污染；加样时要小心，阳性对照应最后加或者通过巢氏靶序列或扩增产物交叉污染；加样时要小心，阳性对照应最后加或者通过巢氏PCRPCRPCRPCR进进进进行扩增能显著提
38、高扩增的特异性行扩增能显著提高扩增的特异性行扩增能显著提高扩增的特异性行扩增能显著提高扩增的特异性条带出现条带出现条带出现条带出现(chxin)(chxin)(chxin)(chxin)但是与目标条带大小不一致；引物聚合形成的引物二聚体，退火但是与目标条带大小不一致；引物聚合形成的引物二聚体，退火但是与目标条带大小不一致；引物聚合形成的引物二聚体，退火但是与目标条带大小不一致；引物聚合形成的引物二聚体，退火时时时时Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+离子浓度过高或者退火温度偏低离子浓度过高或者退火温度偏低离子浓度过高或者退火温度偏低离子浓度过高或者退火温度偏低第58页/共96页第五十九页，共96页
39、。PCR检测检测(jin c)中的常见问题中的常见问题结果出现假阴性结果出现假阴性结果出现假阴性结果出现假阴性PCRPCR产物放置时间过长；产物放置时间过长；产物放置时间过长；产物放置时间过长；PCRPCR产物最好当日上电泳，不要超过产物最好当日上电泳，不要超过产物最好当日上电泳，不要超过产物最好当日上电泳，不要超过48h48h，超过，超过，超过，超过48h48h再上再上再上再上样条带可能不规则甚至消失样条带可能不规则甚至消失样条带可能不规则甚至消失样条带可能不规则甚至消失(xiosh)(xiosh)。Mg2+Mg2+浓度过高或过低；浓度过高或过低；浓度过高或过低；浓度过高或过低；Mg2+Mg
40、2+浓度过高可降低浓度过高可降低浓度过高可降低浓度过高可降低PCRPCR扩增的特扩增的特扩增的特扩增的特 异性，浓度过低则异性，浓度过低则异性，浓度过低则异性，浓度过低则影响影响影响影响PCRPCR扩增产量甚至使扩增产量甚至使扩增产量甚至使扩增产量甚至使PCRPCR扩增失败而不出现扩增条带。扩增失败而不出现扩增条带。扩增失败而不出现扩增条带。扩增失败而不出现扩增条带。反应体系的突然改变；通常进行反应体系的突然改变；通常进行反应体系的突然改变；通常进行反应体系的突然改变；通常进行PCRPCR扩增采用的体积为扩增采用的体积为扩增采用的体积为扩增采用的体积为20ul20ul、30ul30ul、50u
41、l50ul，在放大，在放大，在放大，在放大体系时，一定要模索条件，否则容易失败。体系时，一定要模索条件，否则容易失败。体系时，一定要模索条件，否则容易失败。体系时，一定要模索条件，否则容易失败。退火温度过低；可缓慢提高退火温度退火温度过低；可缓慢提高退火温度退火温度过低；可缓慢提高退火温度退火温度过低；可缓慢提高退火温度第59页/共96页第六十页，共96页。PCR检测检测(jin c)中的常见问题中的常见问题PCRPCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带其原因往往其原因往往其原因往往其
42、原因往往(w(w ngwngw ng)ng)由于凝胶浓度或者没有充分凝固，酶量过多或酶的质量由于凝胶浓度或者没有充分凝固，酶量过多或酶的质量由于凝胶浓度或者没有充分凝固，酶量过多或酶的质量由于凝胶浓度或者没有充分凝固，酶量过多或酶的质量差，差，差，差，dNTPdNTP浓度过高，浓度过高，浓度过高，浓度过高，Mg2+Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。第60页/共96页第六十一页，共96页。IBV结果结果(ji gu)判定判定n n阳阳性性对对照照在在约约7
43、40bp740bp和和290bp290bp处处分分别别有有一一条条特特异异性性的的DNADNA条条带带，阴阴性性对对照照则则无相应的特异性条带出现，则实验成立。无相应的特异性条带出现，则实验成立。n n待待检检样样品品在在相相应应的的位位置置如如出出现现特特异异性性条条带带，或或者者仅仅在在约约740bp740bp出出现现条条带带或或者者仅在月仅在月290bp290bp处出现特异性条带，则均可判为阳性。处出现特异性条带，则均可判为阳性。n n如如果果(rgu(rgu)需需要要进进一一步步验验证证的的话话，可可以以将将获获得得的的大大小小约约为为740bp740bp或或290bp290bp的的P
44、CRPCR产产 物物 回回 收收 纯纯 化化 后后 测测 序序，将将 测测 序序 结结 果果 提提 交交 美美 国国 国国 家家 生生 物物 技技 术术 中中 心心（NCBINCBI）进行）进行BLASTBLAST分析。分析。第61页/共96页第六十二页，共96页。IBV测序结果测序结果(ji gu)分析分析n nIBV IBV S1S1基基因因进进化化(jnhu)(jnhu)分分 析析 表表 明明，分分 离离 株株SD140120-1SD140120-1与与流流行行毒毒株株A2A2、LX4LX4等等均均属属于于基基因因型型LX4LX4，但但不不在在同同一一亚亚分分支支，而而与与HB14011
45、6BHB140116B、JS101024JS101024等等处处于于同同一一亚亚分分支支，与与常常规规疫疫苗苗株株H120H120等等不不属属于于同同一一基基因型。因型。NDV、AIV检测结果的不同检测结果的不同(b tn)分析分析第62页/共96页第六十三页，共96页。其他其他(qt)病原病原疫病名称疫病名称核酸类型核酸类型鸡新城疫、禽流感、鸡传染性支气管炎、鸡病毒性关节炎、禽呼肠孤、传染性法氏囊、禽白血病、鸭黄病毒RNA鸡传染性贫血病、鸡传染性喉气管炎、马立克氏病、网状内皮组织增生病、包涵体肝炎、鸭瘟病毒、鸭细小病毒DNA第63页/共96页第六十四页，共96页。DNA抽提方法抽提方法(fn
46、gf)n n180l180l样样品品+1mlDNAiso+1mlDNAiso，颠颠倒倒混混匀匀，静静置置5min 5min RTRT，4 4 10000g10000g离离心心，10min10min；n n取取上上清清移移至至新新离离心心管管中中，加加500l500l无无水水乙乙醇醇，反反复复(f(f nf)nf)颠颠倒倒直直至至出出现现云云雾雾状状DNADNA沉淀，沉淀，4000g4000g离心离心 5min 5min；n n弃弃上上清清，加加1ml 1ml 75%75%乙乙醇醇（切切勿勿触触及及沉沉淀淀），轻轻缓缓上上下下颠颠倒倒洗洗涤涤，4 4 12000g12000g离心，离心，5min
47、5min；然后再次洗涤；然后再次洗涤；n n弃上清，室温短时干燥；弃上清，室温短时干燥；n n加加3060 l TE/ddH2O3060 l TE/ddH2O溶解，溶解，-20-20保存。保存。第64页/共96页第六十五页，共96页。瑞普诊断中心瑞普诊断中心PCR检测检测(jin c)核酸的优势技术核酸的优势技术n nNDV疫苗(ymio)毒和流行毒株M：1kbMarker1#：NDV基因基因II型病毒型病毒2#：NDV基因基因VII型病毒型病毒N：阴性阴性(ynxng)对照对照P：NDV分离毒阳性对照分离毒阳性对照第65页/共96页第六十六页，共96页。瑞普诊断中心瑞普诊断中心(zhngxn
48、)PCR检检测核酸的优势技术测核酸的优势技术n nPCR区分(qfn)IBV的疫苗毒株和流行毒株M:1kbMarker1#:H120株株2#：4/91毒株毒株N：阴性对照：阴性对照P：IBV分离分离(fnl)毒阳性对照，毒阳性对照，4/91血清型血清型第66页/共96页第六十七页，共96页。PCR检测检测(jin c)核酸的优点及核酸的优点及局限性局限性优点优点必须有一个庞大必须有一个庞大 的已知序列的的已知序列的 数据库。数据库。特异特异 敏感敏感 快速、快速、简便简便 易自动化等易自动化等检测阴性并不能检测阴性并不能 完全判定阴性完全判定阴性PCR的结果的结果 并不总是可靠并不总是可靠局限
49、性局限性第67页/共96页第六十八页，共96页。DNA病毒病毒(bngd)RNA病毒病毒(bngd)组织组织(zzh)病料病料或者鸡或者鸡胚尿囊胚尿囊液液RTPCR凝胶电泳凝胶电泳图谱观察分析图谱观察分析测序分析测序分析小结小结n n步步防止污染；n n设置阴阳性对照；第68页/共96页第六十九页，共96页。IBV、NDV、AIV-H9流行流行(lixng)变化趋势变化趋势阳性数阳性数2013.12013.22013.32013.42013.52013.62013.72013.82013.92013.12013.112013.122014.12014.22014.30102030405060I
50、BVNDVAIV-H9第69页/共96页第七十页，共96页。核酸检测的后续核酸检测的后续(hux)分析分析第70页/共96页第七十一页，共96页。禽原病毒禽原病毒(bngd)分离分离第71页/共96页第七十二页，共96页。实验室常用的病毒分离实验室常用的病毒分离(fnl)方法方法n n接种易感动物(dngw)n n接种SPF鸡胚n n接种敏感细胞，常用细胞如DF-1、CEF、Marc-145等。第72页/共96页第七十三页，共96页。鸡胚接种法检测鸡胚接种法检测(jin c)病原病原n n主要分离毒种：NDV、AIV-H9、AIV-H5、IBV、IBDV、IBHV、ILTV、REOV等。n n