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1、免疫染色后的标本处理免疫染色后的标本处理Prof.李瑞锡李瑞锡 PH.D.复旦大学上海医学院解剖复旦大学上海医学院解剖与组织胚胎学系与组织胚胎学系 免疫电镜技术免疫电镜技术是用电子显微镜观察免疫标记细胞和组织超是用电子显微镜观察免疫标记细胞和组织超微结构的技术微结构的技术是在免疫细胞化学技术和电镜技术的是在免疫细胞化学技术和电镜技术的矛盾结矛盾结合点合点上形成的新方法。上形成的新方法。Protocol for immunohistochemistry免疫组织化学技术与电镜技术的矛盾点免疫组织化学技术与电镜技术的矛盾点:免疫组织化学免疫组织化学:破坏细胞膜破坏细胞膜增强抗体的穿增强抗体的穿透性透
2、性,最大限度地标记抗原！最大限度地标记抗原！电镜技术：最大限度地固定电镜技术：最大限度地固定保存细胞的膜保存细胞的膜性结构性结构，使细胞超微结构清晰美观。，使细胞超微结构清晰美观。两者的两者的矛盾结合点矛盾结合点：既良好地标记了抗原既良好地标记了抗原又完美地保留了膜性结又完美地保留了膜性结构构免疫电镜技术的基本流程免疫电镜技术的基本流程 从动物到电镜照片从动物到电镜照片组织固定、取材组织固定、取材 切片切片（40微米微米)免疫免疫组化染色组化染色 锇酸固定锇酸固定 脱水脱水 树脂包树脂包埋聚合埋聚合 超薄切片超薄切片 电子染色电子染色 电电镜观察照相镜观察照相 Photo shop处理照片处理
3、照片 论文照片版面做成论文照片版面做成免疫染色后的标本处理免疫染色后的标本处理光光 镜镜电电 镜镜光镜光镜 电镜电镜 振动切片机振动切片机40 um免疫染色免疫染色树脂包埋树脂包埋脑脑（for example)vibrating-blade microtome切片切片超薄切片超薄切片60-80 nm、电子染色（醋酸铀、电子染色（醋酸铀/枸橼酸铅枸橼酸铅）电镜观察照相电镜观察照相锇酸固定锇酸固定ultramicrotome8 将切片裱于蛋清涂布的载玻片上，充分晾干。入将切片裱于蛋清涂布的载玻片上，充分晾干。入0.1 mol/L PB。漂洗漂洗5 min3次。次。9 在湿盒和通风厨中，每张切片加于
4、在湿盒和通风厨中，每张切片加于2%锇酸锇酸6080 l。固定。固定1.52h。漂洗。漂洗5 min4次。次。10 经经50%、70%、80%、90%、100%（3次）各级酒精脱水，次）各级酒精脱水，每级每级10 min。11 在切片表面注入少量在切片表面注入少量Epon/丙酮液（丙酮液（Epon：丙酮：丙酮=2：1），用），用注满注满Epon液的塑料胶囊扣入切片上。液的塑料胶囊扣入切片上。12 置聚合箱中，置聚合箱中，37聚合聚合24h，60聚合聚合48h。13 在酒精灯外燃上加热在酒精灯外燃上加热57秒，将标本从载片上分离，剥除塑秒，将标本从载片上分离，剥除塑料胶囊。镜下选择超薄切片部位或细
5、胞。料胶囊。镜下选择超薄切片部位或细胞。14 修块，用超薄切片机切片，片厚修块，用超薄切片机切片，片厚6080 nm。将切片裱于铜网。将切片裱于铜网。15 醋酸铀、枸橼酸铅染色，双蒸水洗净，电镜观察。醋酸铀、枸橼酸铅染色，双蒸水洗净，电镜观察。染色后标本处理的基本步骤染色后标本处理的基本步骤锇酸固定锇酸固定锇酸的配制与管理：用锇酸的配制与管理：用0.1M PB配制，浓度为配制，浓度为2%。用棕。用棕色磨口瓶密封，色磨口瓶密封，4度冰箱内保存。度冰箱内保存。固定时间：固定时间：1.52h注意事项：在通风橱中进行。注意事项：在通风橱中进行。脱水脱水经经50%、70%、80%、90%、100%（3次
6、）各级酒精脱水，每级次）各级酒精脱水，每级10 min 包埋包埋Epon树脂的配置器具：50100ml塑料水杯或相应大小的烧杯；510ml塑料注射器；1ml注射器；医用手套；Epon套剂（4种）。Epon配方与配量：EponDDSAMNADMP-30Total（ml）23.816.011.50.852.111.90.85.750.426.05配制：根据上配方，用注射器取Epon加入杯中，置搅拌器上用磁棒旋转搅拌，依次加入DDSA，NMA，最后加入DMP-30，用膜封住杯口免湿气侵入，继续搅拌30min。树脂包埋树脂包埋聚合：聚合箱内聚合：聚合箱内37 24h，60 48h取块与修块取块与修块超
7、薄切片超薄切片切片刀切片刀载片铜网载片铜网电子染色：电子染色：醋酸铀醋酸铀/枸橼酸铅枸橼酸铅电镜观察电镜观察 实实 验验：分组：分组：2个组（个组（10人人/组）组）实验内容：实验内容：1、灌注、取材。、灌注、取材。带教老师：孙燕带教老师：孙燕 地点：地点：9号号214室室2、切片示教。、切片示教。带教老师：高璐、朱新平、李瑞锡带教老师：高璐、朱新平、李瑞锡地点：地点：9号楼二楼和三楼号楼二楼和三楼时间：时间：8号、号、10号（二、四）中午号（二、四）中午12：0013：20 提交课程报告提交课程报告内容：内容：1）实用免疫电镜技术实用免疫电镜技术的基本步骤的基本步骤 2）个人学习的主要收获个
8、人学习的主要收获 3）对课程的意见和建议对课程的意见和建议时间：时间：12月月15号（星期二）号（星期二）组织化学和细胞化学组织化学和细胞化学 研究生国家统编教材 主编：蔡文琴主编：蔡文琴组织化学与细胞化学研究生国家统编教材第一章组织制片技术与细胞化学技术（北京中医药大学郭顺根）5.0万字第一节组织制片技术取材与固定石蜡切片包埋程序常用染料和染色方法树脂包埋光镜切片技术冰冻切片染色技术整封制片技术第二节常用组织化学染色方法糖原染色方法核酸染色方法酶组织化学染色方法细胞凋亡检测技术第二章免疫细胞化学技术9.0万每节15万字左右第一节免疫细胞化学的免疫学及组织细胞学概述(三军医大学张吉强)抗原抗体
9、补体系统标记物抗体的制备和配制组织材料的处理（取材）细胞和组织的固定组织切片技术免疫染色对照设置第二节免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学的原理荧光抗体荧光免疫细胞化学染色方法（内容上含有对照实验）第三节酶免疫细胞化学技术酶标抗体法非标记抗体酶法结果分析免疫组织化学的几种特殊应用第四节亲和免疫细胞化学技术(三军医大学蔡文琴)生物素-抗生素免疫细胞化学技术葡萄球菌蛋白A凝集素第五节免疫金银及铁标记技术(三军医大学蔡文琴)免疫进技术发展史溶胶的基本概念免疫胶体金银细胞化学染色的固定剂选择光镜免疫金银细胞化学技术附录免疫细胞化学常用试剂介绍第三章原位杂交组织化学技术5.0万第一节原位杂交组织化学技术
10、的基本原理基本原理基本方法第二节核酸探针的种类、制备及标记特异性目的核酸（或基因）的的制备目的核酸的扩增核酸探针的放射性核素标记核酸探针的非放射性标记第三节DNA及寡核苷酸技术在原位杂交组织化学中的应用DNA探针的应用寡核苷酸探针的应用第六节原位杂交组织化学与免疫细胞化学结合法核素原位杂交组化与免疫组化PAP法的联合程序非核素原位杂交与免疫组化联合法第七节原位杂交细胞化学技术的一些新进展荧光原位杂交技术肽-核酸原位杂交细胞化学技术附录一原位杂交组织化学常用试剂及处理第四章电子显微镜技术（首都医科大学周德山）7.0万字，1-3节3.0万字第一节透射电镜透射电镜的基本原理超薄切片技术观察及记录第二
11、节扫描电镜技术扫描电镜概况扫描电镜的生物样品制备几种常用的样品制备方法第三节冷冻蚀刻电镜技术物理固定快速冷冻方法冷冻复型样品制备冷冻超薄切片法第四节电镜细胞化学技术基本原理样品制备常用电镜酶细胞化学方法第五节免疫电镜技术(复旦大学李瑞锡)4.0万字电镜免疫细胞化学技术概述免疫铁蛋白技术免疫酶细胞化学技术免疫电镜胶体金标记法第五节电镜原位杂交技术电镜原位杂交概述几种电镜原位杂交操作程序第五章激光扫描共聚焦显微技术(同济医科大学李和)8.0万字第一节基本原理共聚焦的发展激光扫描共聚焦显微镜共聚焦显微镜图像模式样本制备和图像采集第二节应用细胞内钙离子测定细胞内PH的测定细胞断层扫描与三维重建膜电位测
12、定荧光漂白恢复技术笼锁化合物技术第三节激光扫描共聚焦显微技术展望第六章细胞形态与细胞化学定量分析技术(重庆医科大学唐勇)5.0万字第一节基本概念第二节细胞数的体视学定量研究从轮廓数估计细胞数细胞的直接计数随机抽样第三节成功应用举例第七章细胞化学定量分析技术（暨南医科大学夏潮涌）5.0万字第一节细胞化学计量术概述概论细胞化学计量数的评定第二节显微光度测量术显微光度测量术显微吸收光度数纤维荧光光度术第三节显微分光光度计测量方法吸收光测量荧光光度测量第四节显微图像分析系统组成图像处理与分析原理性能要求图像分析系统性能的生物学方法评估测量参数及其意义第五节流式细胞术流式细胞仪的主要组件二、流式细胞仪的
13、原理三、流式细胞仪的应用四、流式细胞术的质量控制第八章细胞培养及细胞内显微注射技术（北京协和大学章静波）4.0万字第一节细胞培养的基本操作及要求第二节各种细胞的特殊培养方法第三节各种干细胞的培养方法及免疫标记第四节嚣官培养方法第五节细胞内显微注射技术（第三军医大学陈鹏慧，蔡文琴）细胞内注射的类型细胞内注射操作方法细胞内注射与细胞化学技术第九章PCR的基本理论与技术（昆明医学院王廷华）3.0万字第一节概述第二节原位PCR相关技术第三节定量PCR相关技术第四节荧光适时定量PCR技术第十章蛋白质的基本理论与技术（四川大学华西医学中心齐建国）3.0万字第一节概述第二节蛋白质电泳技术第三节蛋白质层析技术第四节蛋白质定量检测技术第五节展望附录三：常用计算机软件的使用2.0万字统计软件SPSS：统计软件Exel图像分析ImageJ图像分析ImageProPlus