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1、会计学1任务任务(rn wu)高效液相色谱法基本原理高效液相色谱法基本原理第一页，共26页。理解已知分析方法中采用的色谱类型能够正确解释色谱分离过程能够根据组分(zfn)性质选择合适的色谱类型 能力(nngl)目标第1页/共25页第二页，共26页。课程(kchng)引入归一化法测定分析纯甲苯归一化法测定分析纯甲苯(ji bn)(ji bn)试试剂的纯度剂的纯度色谱柱色谱柱:4.6mm150mm:4.6mm150mm固定相固定相:十八烷基硅烷键合相十八烷基硅烷键合相(ODS)(ODS)流动相流动相:水水:甲醇甲醇=15:85=15:85外标法测定叶酸片中叶酸的含量外标法测定叶酸片中叶酸的含量色谱
2、柱色谱柱:4.6mm250mm:4.6mm250mm固定相固定相:十八烷基硅烷键合相十八烷基硅烷键合相(ODS)(ODS)流动相流动相:磷酸二氢钠缓冲液磷酸二氢钠缓冲液:甲醇甲醇=80:20=80:20第2页/共25页第三页，共26页。液相色谱是如何完成(wn chng)混合物的分离？课程(kchng)引入混合物中各组分在固定相和流动相之间会发生吸附、溶解或其他亲和作用，这种作用存在差异，从而使各组分在色谱柱中的迁移速度不同(b tn)得到分离石油醚石油醚碳酸钙颗粒碳酸钙颗粒色素色素玻璃柱玻璃柱第3页/共25页第四页，共26页。液液分配色谱法液液分配色谱法实例：归一化法测定分析实例：归一化法测
3、定分析(fnx)(fnx)纯甲苯纯甲苯试剂的纯度试剂的纯度色谱柱色谱柱:4.6mm150mm:4.6mm150mm固定相固定相:十八烷基硅烷键合相十八烷基硅烷键合相(ODS)(ODS)流动相流动相:水水:甲醇甲醇=15:85=15:85 液液(y y)分配色谱第4页/共25页第五页，共26页。液液分配色谱法液液分配色谱法固定相固定相将特定的液态物质涂于担体表面将特定的液态物质涂于担体表面化学键合于担体表面而形成的有机键合层化学键合于担体表面而形成的有机键合层 如如C18C18（十八烷基硅烷）、（十八烷基硅烷）、C8 C8（辛烷基）、氨基（辛烷基）、氨基(nj)(nj)键合硅胶键合硅胶固定相类型
4、固定相类型极性固定相：正相色谱极性固定相：正相色谱 以极性有机基团如胺基（以极性有机基团如胺基（-NH2-NH2）、腈基（）、腈基（-CN-CN）、醚基（）、醚基（-O-O-）等键）等键合在硅胶表面制成的合在硅胶表面制成的 非极性固定相：反相色谱非极性固定相：反相色谱 反相色谱法最常用的固定相是反相色谱法最常用的固定相是C18C18、C8C8和苯基键合相的填料，在分离和苯基键合相的填料，在分离极性很大的化合物时，也可以采用氨基极性很大的化合物时，也可以采用氨基(nj)(nj)、氰基等极性基团键合固定、氰基等极性基团键合固定相。相。液液(y y)分配色谱第5页/共25页第六页，共26页。使用条件
5、使用条件为控制样品在分析过程的解离，常用为控制样品在分析过程的解离，常用(chn yn)(chn yn)缓冲液控制流动相的缓冲液控制流动相的pHpH值，但值，但需要注意的是，需要注意的是，C18C18和和C8C8使用的使用的pHpH值通常为值通常为2.57.52.57.5（2828）。）。太高的太高的pHpH值会使硅胶溶解，太低的值会使硅胶溶解，太低的pHpH值会使键合的烷基脱落。值会使键合的烷基脱落。键合相色谱固定(gdng)相特点使用过程中不流失(lish)均一性和化学稳定性好重现性好分离效率高适于梯度洗脱传质阻抗小第6页/共25页第七页，共26页。反相色谱常见流动相流动相洗脱强度顺序：水
6、 甲醇乙腈乙醇四氢呋喃丙醇二氯甲烷（与水不混溶）若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流动相，可用于分离极性化合物若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等常见固定相反相色谱法最常用的固定相是 C18、C8和苯基键合相的填料(tinlio)，在分离极性很大的化合物时，也可以采用氨基、氰基等极性基团键合固定相。键合相色谱流动(lidng)相第7页/共25页第八页，共26页。疏溶剂理论(lln)：当溶质分子进入极性流动相后,即占据流动相中相应的空间，而排挤一部分溶剂分子；当溶质分子被流动相推动和固定相接触时，溶质分子的非极性部分或非极性分子）会将非极性固定
7、相上附着的溶剂膜排挤开，直接和非极性固定相上的烷基官能团相结合（吸附）形成缔合物，构成单分子吸附层；当流动相极性减小时，这种疏溶剂斥力下降，会发生解缔，并把溶质分子释放而被洗脱下来反相色谱法的分离反相色谱法的分离(fnl)(fnl)机理机理1 1第8页/共25页第九页，共26页。影响溶质保留的三个主要因素：溶质分子中非极性部分的总表面积 溶质和固定相接触的总表面积愈大，保留值愈大，所以溶质的极性愈弱，疏水性越强，保留值越大。键合相上的烷基总面积 烷基键合固定相的作用在于提供非极性的作用表面。随着碳链的加长，烷基的疏水特性增强，溶质的保留值也随烷基碳链长度(chngd)的增加而增大。流动相的表面
8、张力 流动相的表面张力愈大，介电常数愈大，极性亦愈强；溶质和烷基键合相的缔合作用愈强，流动相的洗脱强度弱，导致溶质的保留值大。反相键合相色谱法的分离反相键合相色谱法的分离(fnl)(fnl)机机理理2 2第9页/共25页第十页，共26页。时间，时间，min固定相：固定相：C1固定相：固定相：C8固定相：固定相：C181-尿嘧啶；尿嘧啶；2-苯酚；苯酚；3-乙酰苯；乙酰苯；4-硝基苯；硝基苯；5-苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-甲苯甲苯例：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离(fnl)效果越好。分离机理分离机理(j l)(j l)实例实例第10页/共25页第十一页，共26页。正相色谱法 反相色谱法
9、1.极性固定相 聚乙二醇、氨基与腈基键合相 2.相对非极性流动相 正已烷、环已烷 3.极性调节剂 乙醇、四氢呋喃、三氯甲烷 4.分离中等极性和极性较强化合物.酚类、胺类、羰基类及氨基酸类 5.组分流出顺序 极性小先洗出 1.非极性固定相 C18（简称ODS）、C8 2.极性流动相 水或缓冲液 3.极性调节剂 甲醇、乙腈、四氢呋喃4.分离非极性和极性较弱化合物 占整个HPLC应用的80%左右 5.组分流出顺序 极性大先洗出 液液(y y)分配色谱第11页/共25页第十二页，共26页。其他类型色谱法其他类型色谱法 按分离机制分类按分离机制分类(fn li)(fn li)：液固吸附色谱法液固吸附色谱
10、法离子色谱法离子色谱法凝胶色谱法（分子排阻色谱法）凝胶色谱法（分子排阻色谱法）（空间排阻色谱法）（空间排阻色谱法）其他(qt)类型色谱法第12页/共25页第十三页，共26页。氯化噻吩氯化噻吩(sifn)嗪嗪四种异构体的分离色谱图四种异构体的分离色谱图 氯化噻吩嗪四种异构体的分离异构体具有不同的空间排列方式，因此吸附(xf)剂对它们的吸附(xf)能力有所不同，从而得到了分离。液固吸附色谱(s p)实例第13页/共25页第十四页，共26页。液固吸附色谱法液固吸附色谱法固定相：吸附剂为硅胶固定相：吸附剂为硅胶(u jio)u jio)或氧化铝，粒度或氧化铝，粒度5-5-10m10m流动相：有机溶剂流
11、动相：有机溶剂适用于分离分子量适用于分离分子量200-1000200-1000的组分，大多数用于的组分，大多数用于非离子型化合物的分离，常用于分离同分异构体。非离子型化合物的分离，常用于分离同分异构体。液固吸附(xf)色谱各组分的出峰顺序 极性较小组(xioz)分，吸附力较弱，容易解吸，先流出。极性较大组分滞留作用大，后流出。饱和烃 烯 芳烃 醚 醛酮 酸第14页/共25页第十五页，共26页。吸附(xf)脱附再吸附(xf)再脱附 分离过程是一个吸附(xf)脱附的平衡过程。液固吸附色谱法分离(fnl)机理 液固吸附色谱分离(fnl)机理第15页/共25页第十六页，共26页。离子交换离子交换(ji
12、ohun)(jiohun)色谱法色谱法油田水质中的阴离子分析油田水质中的阴离子分析固定相：薄壳型阴离子交换固定相：薄壳型阴离子交换(jiohun)(jiohun)树脂树脂(3250mm)(3250mm)流动相：流动相：0.003molL-1 NaHCO3/0.0024 molL-0.003molL-1 NaHCO3/0.0024 molL-1Na2CO31Na2CO3 离子(lz)色谱法实例第16页/共25页第十七页，共26页。离子交换色谱法离子交换色谱法固定相固定相:离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，架，在表面在表面(bi
13、omin)(biomin)未端芳环上接上羧基、磺酸基未端芳环上接上羧基、磺酸基 阳离子交阳离子交换树脂换树脂在表面在表面(biomin)(biomin)未端芳环上接上季胺基未端芳环上接上季胺基 阴离子交换树脂阴离子交换树脂流动相：电解质溶液、有机弱酸或有机弱酸盐溶液流动相：电解质溶液、有机弱酸或有机弱酸盐溶液 离子交换(l z jio hun)色谱法 第17页/共25页第十八页，共26页。离子交换色谱法离子交换色谱法分离原理分离原理 树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的 离子进行可逆交换而分离。离子进行可逆交换而分离。
14、应用应用 离子交换色谱法主要用于分析阴，阳离子，凡是在溶剂中能够电离离子交换色谱法主要用于分析阴，阳离子，凡是在溶剂中能够电离 的物质通常都可以的物质通常都可以(ky)(ky)用离子交换色谱法来进行分离。用离子交换色谱法来进行分离。分析物质分析物质 有机酸、氨基酸、多肽及核酸。有机酸、氨基酸、多肽及核酸。离子交换(l z jio hun)色谱法分离机理第18页/共25页第十九页，共26页。凝胶色谱凝胶色谱(s p(s p)（分子排阻色谱（分子排阻色谱(s p(s p)法）法）油田用驱油剂聚丙烯酰胺损失量的测定？油田用驱油剂聚丙烯酰胺损失量的测定？色谱色谱(s p(s p)柱：柱：150mm46
15、mm150mm46mm 固定相：二醇基键合相，孔径固定相：二醇基键合相，孔径200A200A，粒径，粒径5um5um 流动相流动相:甲醇甲醇/0.05mol/LNaH2PO4/0.05mol/LNaH2PO4 凝胶色谱法实例(shl)1-聚丙烯酰胺2-原油(yunyu)+石油磺酸盐+氯化钠第19页/共25页第二十页，共26页。n n以凝胶以凝胶(gel)(gel)为固定为固定(gdng)(gdng)相。相。它类似于分子筛，但凝胶的孔径比它类似于分子筛，但凝胶的孔径比分子筛要大得多。分子筛要大得多。n n小分子量的化合物可以进入孔中，小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不滞
16、留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。能进入孔中，直接随流动相流出。n n常用于分离高分子化合物，如组织常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。提取物、多肽、蛋白质、核酸等。凝胶色谱(s p)分离示意图 凝胶色谱：（分子排阻色谱法）分离(fnl)机理 凝胶色谱分离机理第20页/共25页第二十一页，共26页。正确地选择色谱正确地选择色谱(s p)(s p)类型类型尽可能多的了解样品性质尽可能多的了解样品性质化学结构化学结构极性和稳定程度极性和稳定程度水中和有机溶剂中溶解度水中和有机溶剂中溶解度相对分子质量的大小相对分子质量的大小熟悉各种色谱熟悉各种色谱(s
17、 p)(s p)类型主要特点应用范围类型主要特点应用范围色谱类型(lixng)选择第21页/共25页第二十二页，共26页。色谱(s p)类型选择第22页/共25页第二十三页，共26页。液相色谱法实例(shl)按固定相与流动相相对极性的不同，液液分配色谱可分为哪两类方法？现在(xinzi)有A、B两物质，极性 AB，问在两种液液分配色谱上的出峰顺序如何？分离下述化合物，宜选用何种色谱方法？（A）聚苯乙烯相对分子量分布 （B）多环芳烃（C）氨基酸 （D）Ca2+，Ba2+，Mg2+第23页/共25页第二十四页，共26页。下次课程(kchng)问题三种组分苯、萘、联苯，如何选择一个最佳的色谱分离条件，既能达到良好(lingho)的分离度，又能在短时间内完成分析任务？第24页/共25页第二十五页，共26页。内容(nirng)总结会计学。第1页/共25页。流动相:水:甲醇=15:85。流动相:水:甲醇=15:85。流动相:磷酸二氢钠缓冲液:甲醇=80:20。流动相洗脱强度顺序：水甲醇乙腈乙醇四氢呋喃丙醇二氯甲烷（与水不混溶）。若采用(ciyng)含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流动相，可用于分离极性化合物。当溶质分子进入极性流动相后,即占据流动相中相应的空间，而排挤一部分溶剂分子。流动相：电解质溶液、有机弱酸或有机弱酸盐溶液第二十六页，共26页。