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1、实验目的掌握GST亲和层析纯化目的蛋白的原理和实验方法（第一部分）掌握SDS-PAGE检测目的蛋白原理和方法（第二部分）第1页/共38页第一部分 GST亲和层析纯化目的蛋白第2页/共38页亲和层析原理 生物大分子与配体特异非共价结合。酶-底物或底物类似物（竞争性抑制剂）抗体-抗原激素-受体外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体核酸-互补序列（Oligo-dT）第3页/共38页亲和层析原理第4页/共38页第5页/共38页第6页/共38页GSH-Sepharose 4B第7页/共38页GSH-Sepharose 4BGSH-Sepharose 4B第8页/共38页GSH-Sepharose 4BG
2、SH-Sepharose 4B第9页/共38页亲和层析流程第10页/共38页第一部分 实验步骤第11页/共38页一、细胞破碎3600 mL诱导的菌液，离心分装到12只50 mL离心管，-20保存；（每个班用2管）每管加30 mL PBS缓冲液，混匀；超声3S，暂停5S，持续15 min；4，10000 rpm，离心10 min；取50 uL上清，作为纯化前的样品；每组取3-5 mL上清液，上柱纯化。第12页/共38页二、装GSH-Sepharose 4B柱1.清洗和装好层析柱，封闭出口；2.加入2 mL PBS；3.取1-2 mL GSH-Sepharose 4B，加入柱子中；4.打开柱子出口
3、，使PBS缓慢流出。注意：始终保持柱内的液面高于 GSH-Sepharose 4B 第13页/共38页三、纯化目的蛋白1.用5 mL PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。2.将混合蛋白质溶液2-3 mL加到柱子中。3.用5 mL PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。4.加入1.0 mL 洗脱液。5.用1.5 mL离心管收集洗脱液，每管收集 0.2 mL（3-4滴），共收集5管。6.用5 mL PBS 缓冲液洗柱子3遍，关闭出口。7.SDS-PAGE检测第2和3管中的目的蛋白。第14页/共38页四、SDS-PAGE样品制备1号：过柱前的蛋白溶液80 uL2号：收集的蛋白溶液（2号管）80 uL3号：收集的蛋
4、白溶液（3号管）80 uL 1-3号分别加入20 uL 5上样缓冲液，混匀后在沸水中加热3 min。第15页/共38页 1 2 3 M 1 2 3 M 样品加30 uL30 uLMarkerMarker加10 uL10 uL第16页/共38页亲和层析试剂PBS（pH 7.4）:NaCl（58.5）40 g；KCl（74.5）1.0 g；KH2PO4（136.09）1.2 g；Na2HPO412H2O（358.14）18.1 g；加水定容到5000 mL。第17页/共38页亲和层析试剂50 mM Tris-HCl（pH 8.0）:Tris（121.14）6.055 g，溶于900 mL水，用HC
5、l调pH到8.0，用水定容至1000 mL。洗脱液:还原型谷胱甘肽（307.32）0.15366 g，溶于50 mL 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）中。第18页/共38页第二部分SDS-PAGE检测目的蛋白质第19页/共38页实验目的掌握SDS-PAGE检测蛋白原理和方法掌握垂直板电泳的实验方法第20页/共38页蛋白质与SDS按1:1.4比例形成复合物，消除了各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。在15-200 KD之间，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系：logMW=K-bm实验原理第21页/共38页第22页/共38页 连续系统：电泳体系中缓冲
6、液pH值及凝胶浓度相同。（电荷效应、分子筛效应）不连续系统：缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性。（电荷效应、分子筛效应、浓缩效应）第23页/共38页1.凝胶孔径的不连续性（2种孔径）2.缓冲液离子成分及pH值的不连续性（2种缓冲体系，3种pH）：浓缩胶，pH6.8，蛋白质分子的迁移率比Cl-低，比Gly高。浓缩效应第24页/共38页3.电位梯度不连续性：快离子（Cl-）后面形成高电位梯度区，慢离子（Gly）前面形成低电位梯度区，高电位梯度和低电位梯度之间的地方，形成一个稳定而不断向阳极移动的界面，蛋白质分子在界面处浓缩成一个狭小的中间层。浓缩效应第25页/共38页实验步骤1.洗
7、净玻璃板，吹干，安装制胶器；2.制作12%分离胶。按下表顺序加试剂，混匀，加入 玻璃板间，加液高度与电泳槽中的横杠上沿等高；3.用1 mL蒸馏水封住液面，室温30 min，分离胶与水之间出现分界线，倒掉水层，用滤纸吸干残余的水；4.配制5%浓缩胶，混匀，加入玻璃板间，插入梳子，静置30 min；第26页/共38页12%分离胶试剂名称试剂名称加液量加液量ddH2O2.5 mL30%Acr-Bis（29:1）3.0 mL1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8）2.0 mL10%SDS75 uLTEMED（加速剂）（加速剂）10 uL10%AP（催化剂，最后加）（催化剂，最后加）75 uL
8、总体积总体积7.5 mL第27页/共38页试剂名称试剂名称加液量加液量ddH2O3.4 mL30%Acr-Bis（29:1）0.86mL1.5 mol/L Tris-HCl（pH6.8）0.62mL10%SDS50 uLTEMED20 uL10%AP（最后加）（最后加）50 uL总体积总体积5.0 mL5%5%浓缩胶浓缩胶 第28页/共38页5.将胶板放入电泳槽，加入1Tris-Gly电泳缓冲液，轻轻拔掉梳子；6.点样：每个样点30 uL，Marker点15 uL；7.电泳：100 V，约20 min，样品进入分离胶后，将电 压调到130 V，继续电泳。溴酚蓝接近胶底部时，停 止电泳；实验步骤
9、第29页/共38页8.拆开玻璃板，切除浓缩胶，将分离胶放入塑料盒内，加入染色液，振荡30 min；9.回收染色液，加水清洗，用微波炉高火煮 4-5 min，重复2-3次；10.观察胶中的蛋白质条带。实验步骤第30页/共38页 纯化前 纯化后 MarkerMarker第31页/共38页实验试剂 蛋白质分子量标准 兔磷酸化酶B 97400 B 97400 牛血清白蛋白 6620066200 兔肌动蛋白 4300043000 牛碳酸酐酶 3100031000 胰蛋白酶抑制剂 2010020100 鸡蛋清溶菌酶 1440014400第32页/共38页实验结果绘制标准曲线：log MW=K-bm 蛋白质
10、区带中心至分离胶上沿距离相对迁移率=溴酚蓝至分离胶上沿距离 蛋白标准的分子量对数作为纵坐标，相对迁移率作横坐标，做标准曲线。根据目的蛋白的迁移率以及标准曲线，可以计算相对分子量。第33页/共38页SDS-PAGE试剂1.30%（W/V）凝胶液：丙烯酰胺（Acr）29.0 g，亚甲基双丙烯酰胺（Bis）1.0 g，加水到100 mL。2.分离胶缓冲液（pH8.8，1.0 mol/L Tris-HCl）：三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1 g，加80 mL蒸馏水，用1.0 mol/L HCl调节pH到8.8，用蒸馏水稀释到100 mL。第34页/共38页3.浓缩胶缓冲液（1.0 mol/L Tr
11、is-HCl，pH 6.8）Tris 12.1 g，加60 mL蒸馏水，用1.0 mol/L HCl调节pH到6.8，加蒸馏水到100 mL。4.10%（W/V）SDS5.10%（W/V）过硫酸铵（现用现配）第35页/共38页6.10电极缓冲液（pH 8.3）：Tris 30.3 g，Gly 144.2 g，SDS 10 g，加水到1000 mL。（用时稀释10倍）7.蛋白质标准溶液：低分子量蛋白质标准，加200 uL水溶解，加50 uL上样缓冲液。第36页/共38页8.上样缓冲液（5）：1.0 moL Tris-HCl（pH 6.8）40 mL，甘油40 mL，巯基乙醇20 mL，SDS 8.0 g，溴酚蓝0.005 g，体积100 mL。9.染色液：考马斯亮蓝R-250 1.0 g，250 mL甲醇（乙醇），80 mL冰乙酸，670 mL水。10.脱色液：50 mL甲醇，75 mL冰乙酸，875 mL水。第37页/共38页感谢您的观看！第38页/共38页