《反向遗传学及其相关技术.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《反向遗传学及其相关技术.pptx（74页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、一、概述（一）遗传研究的二条途径1、表里：正向遗传学研究杂交或诱变表型观察遗传规律确定存在的基因及数目基因的功能及作用性质。这一途径是从生物体的性状、表型变化来研究遗传物质的组成、分布与传递规律，属于正向遗传学采用的研究方法。第1页/共74页2、里表：反向遗传学研究在已知DNA序列的基础上，通过DNA重组、定点突变、插入/缺失等遗传修饰手段创造突变体并研究突变所造成的表型效应，从而研究基因的生物学功能，阐明生命的本质现象与规律。与反向遗传学相关的遗传操作技术为反向遗传学技术。第2页/共74页（二）RNA病毒的反向遗传学 n采采用用病病毒毒的的遗遗传传材材料料，在在培培养养细细胞胞或或易易感感宿
2、宿主主中中重重新拯救出活病毒或类似病毒物质。新拯救出活病毒或类似病毒物质。n能能够够拯拯救救病病毒毒的的遗遗传传材材料料称称为为感感染染性性克克隆隆，一一般般是是在在细细菌菌质质粒粒中中含含有有整整个个病病毒毒基基因因组组的的cDNA拷拷贝贝，使使得得cDNA本本身身或或从从cDNA体体外外转转录录所所得得的的RNA具具有感染性。有感染性。nRNA病病毒毒的的反反向向遗遗传传系系统统通通过过定定向向修修饰饰病病毒毒的的基基因因组组序序列列，检检测测被被拯拯救救的的人人工工改改造造病病毒毒的的表表型型，可可以以在在体体内内(in vivo)有有效效地地研研究究病病毒毒基基因因结结构构、功功能能和
3、和病毒病毒-宿主相互作用。宿主相互作用。第3页/共74页nRNA病毒的反向遗传操作病毒的反向遗传操作 RT-PCR构建构建RNA病毒的全长病毒的全长cDNA，并进行遗传修饰，并进行遗传修饰 与与RNA聚合酶启动子结合聚合酶启动子结合 体外转录病毒体外转录病毒RNA 转录物转录物RNA感染哺乳动物细胞感染哺乳动物细胞 拯救到活病毒拯救到活病毒 拯救病毒的表型变化拯救病毒的表型变化 病毒基因组的表达、调控、致病机理、病毒基因组的表达、调控、致病机理、病毒与宿主细胞互作、疫苗制造等病毒与宿主细胞互作、疫苗制造等第4页/共74页单正股RNA病毒：RNA聚合酶+mRNA +中间型 结构蛋白+子代正股RN
4、A单负股RNA病毒：RNA聚合酶 +结构蛋白子代负股RNA逆转录病毒：RNARNA/DNA中间体逆转录酶DNA/DNA宿主子代RNA正股RNA与负股RNA病毒、逆转录病毒?第5页/共74页（三）真核生物的反向遗传学采用反向遗传学鉴定基因功能是真核生物功能基因组学的主要内容。研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除/基因打靶、基因陷阱、基因激活等手段。利用基因敲除或基因沉默而产生的功能变化研究基因功能是主要的反向遗传学技术。第6页/共74页二、反向遗传学相关技术1、基因的同源重组2、基因的位点突变3、基因沉默基因敲除第7页/共74页利用DNA转化技术，将含有目的基因和靶基因同源片段
5、的重组载体导入靶细胞，通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组，将外源基因整合入内源基因组内，使外源基因得以表达。通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变，达到研究基因功能的目的。1、基因的同源重组第8页/共74页完完全全敲敲除除：通通过过同同源源重重组组直直接接将将靶靶基基因因在在细胞或者动物个体中的活性完全消除。细胞或者动物个体中的活性完全消除。条条件件敲敲除除：将将某某个个基基因因的的修修饰饰限限制制于于特特定定类型的细胞或个体发育特定的阶段。类型的细胞或个体发育特定的阶段。完全敲除条件敲除特定组织/时间基因敲除基因敲除第9页/共74页1）通过同源重组的基因敲除步骤构建重组
6、载体 重组DNA转入受体细胞核内 筛选目的细胞 转基因生物重组载体的类型：a)替换性载体系统：包括同源序列片段、替换基因的启动子、报道基因等成分。b)插入性载体系统：插入基因片段(目的基因)、同源序列片段、标志基因片段。第10页/共74页用用替替换换型型（a）或或插插入入型型（b）载载体体进进行行完完全全基基因因敲敲除除实验实验第11页/共74页2）Res同源重组系统源于噬菌体Res重组酶的重组系统Ha 和Hb:同源重组区域 Pa 和Pb:引物位点sm:筛选标记Red 同源重组技术用于基因打靶第12页/共74页3）Cre-LoxP同源重组系统 源自P1噬菌体的重组系统 属属于于传传统统的的同同
7、源源重重组组载载体体，但但具具有有时时空空调调控控的的功功能能。该该系系统统由由P1噬噬菌菌体体的的Cre重重组组酶酶和和LoxP位位点点两两部部分组成。分组成。nCre重重组组酶酶：由Cre基因编码，识别LoxP位点，介介导导两两个个LoxPLoxP位位点点（序序列列）之之间间的的特特异异性性重重组组，使使LoxPLoxP位点间的基因序列被删除或重组。位点间的基因序列被删除或重组。nLoxP位位点点：由2个13bp的反向重复序列和1个8bp的间隔区域构成。第13页/共74页Cre酶 Cre酶 Cre酶 CreCre重组酶13bp的反向重复序列 第14页/共74页Cre-LoxP 重组系统的特
8、点CreCrea)Cre 重组酶所催化的是一个可逆的重组事件重组酶所催化的是一个可逆的重组事件b)Cre催化重组不需要任何辅助因子的参与催化重组不需要任何辅助因子的参与介导两个同向介导两个同向LoxP位点之间序列的插入位点之间序列的插入/缺失（下左）缺失（下左）介导两个反向介导两个反向LoxP位点之间序列颠倒（下右）位点之间序列颠倒（下右）介导两条含介导两条含LoxP位点位点DNA链的交换或染色体易位。链的交换或染色体易位。第15页/共74页Cre-Loxp gene knock-out system第16页/共74页4)高等动物基因敲除技术真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，
9、用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方 便。胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。第17页/共74页模式动物小鼠中完全基因敲除的步聚近交系，白色，易产生免疫缺陷 第18页/共74页2、基因的位点突变1）点突变TILLING技术TILLING(targeting induced local lesions in genomes)定向诱导基因组局部突变，是一种
10、快速有效地从由化学诱变剂(EMS)诱变过的突变群体中鉴定出点突变的方法。先用化学诱变剂(甲基磺酸乙酯，EMS)诱发产生一系列的点突变，再用设计的特异性引物进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物变性和退火形成异源双链核酸分子，再用特异切割错配的内切酶CELl酶切，最后变性处理后采用双色聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳检测分析。第19页/共74页（建池）第20页/共74页第21页/共74页TILLING特点：特点：TILLING技术属于高频率点突变和技术属于高频率点突变和PCR筛选相结筛选相结合的技术，可发现基因的错义突变、基因截短型合的技术，可发现基因的错义突变、基因截短型损伤等突变类型。损伤等突变
11、类型。u可可获获得得大大量量的的等等位位基基因因系系列列，对对长长度度很很小小基基因因，复等位基因等具有独特的技术优势。复等位基因等具有独特的技术优势。u可可诱诱导导产产生生高高频频率率的的点点突突变变，筛筛选选目目的的基基因因需需要要较小的突变群体。较小的突变群体。u不不依依赖赖于于农农杆杆菌菌介介导导转转化化或或内内源源标标签签系系统统，无无需需耗时的转基因和复杂的组织培养。耗时的转基因和复杂的组织培养。u需要知道所研究基因的序列。需要知道所研究基因的序列。第22页/共74页2）随机插入突变A.T-DNA插入突变插入突变 以以农农杆杆菌菌介介导导的的转转化化为为基基础础的的一一种种插插入入
12、突突变变研研究究方方法法，根根据据插插入入位位点点的的基基因因序序列列与与植植物物表表型型变变异异等等的的相相互互关关系系可可以以从从基基因因组组中中分分离离出出相相应应的的基基因因并并鉴定其功能。鉴定其功能。构建T-DNA载体转化突变体的筛选及遗传分析分离T-DNA 插入位点的侧翼序列基因的定位、结构与功能分析。第23页/共74页T-DNA法法敲敲除除植植物物基基因因及突变体筛选：及突变体筛选：a.引引物物设设计计。LP和和RP分分别别代代表表插插入入基基因因两两端端的的引引物物，LB是是指指载载体体上上的的一一段段 引引物物。旁旁邻邻序序列列是是经经测测序序后后获获得得的的DNA序列。序列
13、。b.PCR产产物物电电泳泳结结果果。分分别别代代表表野野生生型型、杂杂合合子子和和纯合子纯合子PCR条带。条带。第24页/共74页T-DNA插入特点：插入特点：n不能控制其在生物体基因组中的插入位点。在植物不能控制其在生物体基因组中的插入位点。在植物中用中用T-DNA 插入来敲除一个特定基因仍需要运气。插入来敲除一个特定基因仍需要运气。n隐性突变与显性突变：隐性隐性突变与显性突变：隐性表型的变化只能在表型的变化只能在转化体的部分后代中体现出来（基因敲除）；显性转化体的部分后代中体现出来（基因敲除）；显性可以在转化体中直接观察到（基因激活）。可以在转化体中直接观察到（基因激活）。n某些特定基因
14、，由于其特性在基因敲除后并不体现某些特定基因，由于其特性在基因敲除后并不体现出功能的丧失。原因：重要的功能基因突变致死和出功能的丧失。原因：重要的功能基因突变致死和冗余基因。冗余基因。n染色体重排：突变体表型与染色体重排：突变体表型与T-DNA 插入无关。插入无关。n效率不高，工作量大。建立饱和的突变体库。效率不高，工作量大。建立饱和的突变体库。第25页/共74页B.转座子插入突变转座子插入突变利用某些能随机插入基因序列的转座子，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。由转座子引起的突变可以转座子DNA为探针，从突
15、变体的基因组DNA文库中筛选到突变的基因，再利用这部分序列从野生型基因文库中获得完整的基因。也可以利用PCR的方法扩增转座子的侧翼序列，进而得到完整的基因信息。第26页/共74页转座子插入特点：转座子插入特点：插入的是完整的元件，便于分析。插入的是完整的元件，便于分析。可从插入位点切除，产生回复突变，因此不仅可以可从插入位点切除，产生回复突变，因此不仅可以据此确认真正由转座子引起的突变，还可以进一步据此确认真正由转座子引起的突变，还可以进一步验证突变基因的功能。验证突变基因的功能。转座子倾向于插入转座子的临近区域，可以用来研转座子倾向于插入转座子的临近区域，可以用来研究基因组某一局部区域的结构
16、。究基因组某一局部区域的结构。通过不断跳动产生新的突变，相对较少的起始转化通过不断跳动产生新的突变，相对较少的起始转化系就可以获得整个基因组的饱和突变，大大减少了系就可以获得整个基因组的饱和突变，大大减少了工作量。工作量。可以应用于转化效率不高的植物。可以应用于转化效率不高的植物。第27页/共74页转座子系统转座子系统I.Ac/Ds 系统系统 由由自自主主性性元元件件（Ac）和和非非自自主主性性元元件件（Ds）构构成成。Ds元元件件能能够够在在Ac编编码码的的转转座座酶酶的的作作用用下下移移动动，去去除除Ac元件可使其自身不能转座。元件可使其自身不能转座。通通过过遗遗传传杂杂交交引引入入自自主
17、主性性元元件件，转转座座子子插插入入序序列列可可以以重重新新移移动动。因因此此，Ac/Ds 转转座座子子插插入入系系统统只只需需要要少少量量的的转转基基因因品品系系（启启动动品品系系）作作为为转转座座源源即可。即可。第28页/共74页在真核系统中，转座插入事件常不能产生可见的表型，这是因为功能基因的冗余或在早期产生致死效应。采用经修饰的转座子可克服这些困难。修饰：转座因子后带一个报告基因，报告基因的表达只有在转座事件发生的情况下才能获得，这样就可以通过报告基因来检测转座子的表达情况。修饰的Ac/Ds转座子系统第29页/共74页n增强子陷阱增强子陷阱(enhancer trap)：转座子含：转座
18、子含有一个具弱小启动子驱动的报告基因。报告有一个具弱小启动子驱动的报告基因。报告基因的表达只有在转座发生在内源增强子附基因的表达只有在转座发生在内源增强子附近时才能获得。近时才能获得。n启动子陷阱启动子陷阱(promoter trap)：转座子带有：转座子带有一个无启动子的报告基因，这个基因只有在一个无启动子的报告基因，这个基因只有在转座子插入一个植物活跃的内源启动子下游转座子插入一个植物活跃的内源启动子下游时才能表达。时才能表达。修饰的方法-增强子陷阱与启动子陷阱第30页/共74页II.Mu转座子转座子系统系统n转转座座子子打打靶靶载载体体是是以以两两种种噬噬菌菌体体Mu为为基基础础的的mi
19、ni-Mu转座子，每个转座子上都携带标记基因。转座子，每个转座子上都携带标记基因。n可可以以在在拟拟删删除除基基因因两两侧侧各各插插入入一一个个mini-Mu转转座座子，然后在两个插入位点之间制造缺失。子，然后在两个插入位点之间制造缺失。n这这种种缺缺失失可可以以使使两两个个转转座座子子加加上上靶靶区区之之间间的的部部分分基因转移。基因转移。n特点：特点：u不需要知道基因组序列，仅已知外显子即可不需要知道基因组序列，仅已知外显子即可u载体构建迅速，技术简单载体构建迅速，技术简单u载载体体可可以以携携带带多多种种不不同同抗抗性性基基因因，可可以以同同时时处处理理多基因。多基因。第31页/共74页
20、三、基因沉默技术I.反义RNAII.RNA干扰（RNAi）第32页/共74页I.反义反义RNA技术技术反义反义RNA技术是根据技术是根据RNA序列人工合成的互补序列人工合成的互补RNA。根据反义。根据反义RNA的作用机制可将其分为三类：的作用机制可将其分为三类：1、反反义义RNA是是直直接接作作用用于于靶靶mRNA的的核核蛋蛋白白体体结结合合位位点点或或与与靶靶mRNA直直接接结结合合形形成成双双链链RNA，从从而而直直接接抑抑制制mRNA的翻译或被的翻译或被RNA酶酶识别降解。识别降解。2、反反义义RNA是是与与mRNA的的非非编编码码区区结结合合，引引起起mRNA构构象的变化，从而抑制其翻
21、译。象的变化，从而抑制其翻译。3、反反义义RNA是是作作用用于于基基因因的的启启动动子子，直直接接抑抑制制靶靶mRNA的转录。的转录。第33页/共74页（一）概念RNA干扰(RNA interference，RNAi)：与靶基因序列同源的双链RNA所诱导的一种序列特异性转录后基因沉默现象。II.RNA干扰干扰第34页/共74页基因沉默转录水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing,TGS)转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing,PTGS)基因沉默第35页/共74页转录水平的基因沉默（TGSTGS）是指基因在
22、细胞核内RNARNA合成受到了阻止而导致基因沉默。转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种：1.1.基因及其启动子甲基化：通常发生在DNADNA的CGCG序列的碱基上，该区域碱基甲基化往往导致转录受抑制。2.2.同源基因间的反式失活：拥有同源序列的沉默位点和其他位点的DNADNA的相互作用而引起的基因沉默。甲基化并失活的基因能作为一种“沉默子”，对其他具有同源性的靶基因施加一种反式作用，使具有同源序列的靶基因发生甲基化并导致失活。反式失活的靶基因既可以与沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。第36页/共74页3.后成修饰作用导致
23、的基因沉默：指转基因的序列和碱基组成不发生改变，但是其功能却在个体发育的某一阶段受到细胞内因子的修饰作用后而关闭。这种修饰作用所造成的转基因沉默是可以随着修饰作用的解除而被消除。后成修饰作用导致的转基因沉默与受体植物的核型构成有关。4.重复序列：外源基因如果以多拷贝形式整合到同一位点上，形成首尾相连的正向重复或头对头、尾对尾的反向重复，则不能表达，而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。这种重复序列诱导的基因沉默可能是重复序列间自发配对，甲基化酶特异性识别这种配对结构而使其甲基化，从而抑制其表达。第37页/共74页转录后水平基因沉默（PTGSPTGS）则是指基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞
24、质里却无相应的mRNAmRNA存在的现象。引起转录后水平的基因沉默机制主要有以下几种：1.1.共抑制：由NapoliNapoli在转CHSCHS基因的矮牵牛花中发现，普遍存在于转基因植物中。其发生是由于外源基因编码区与受体细胞基因间存在同源性而导致外源基因与内源基因的表达同时受到抑制。具有同源性的外基因和内源基因在细胞核内的转录速率很高，但在细胞质内无mRNAmRNA积累，是典型的转录后水平基因沉默。共抑制的产生不仅同内、外源基因间编码区的同源性有关，还与控制外源基因的启动子的强度等因素有关。第38页/共74页2.基因压制：CogoniCogoni等首先在粗糙脉孢霉的转化实验中发现，外源基因可
25、以抑制自身和相应内源基因的表达，他们把这一现象定为基因压制。基因压制是可逆的，而且这种逆转会伴随有外源拷贝的丢失。基因压制发生在转录后水平，导致已复制的稳定态mRNAmRNA大量减少。3.3.RNARNA干扰：指将与靶基因的mRNAmRNA同源互补的双链RNA RNA(dsRNA)(dsRNA)导入细胞后并被切割成21212323个核苷酸长度的短核苷酸双链，在其它作用因子的参与下能够特异地与其同源的mRNAmRNA结合并导致其降解，从而产生相应的功能表型缺失。第39页/共74页RNAi 一种新的遗传工具RNAi是是植植物物、果果蝇蝇、线线虫虫和和包包括括哺哺乳乳动动物物在在内内的的许许多多生生
26、物物抵抵抗抗病病毒毒感感染染和和限限制制转转座座子子运运动动的的一一种种自然存在的防御机制。自然存在的防御机制。RNAi可可以以作作为为一一种种简简单单、有有效效的的代代替替基基因因敲敲除除的的遗遗传传工工具具，来来制制备备特特定定基基因因缺缺失失表表型型的的个个体体，从从而研究该基因的功能而研究该基因的功能.这这项项技技术术在在疾疾病病的的基基因因治治疗疗上上也也有有光光明明的的应应用用前前景景。特特别别可可以以用用于于阻阻断断某某些些突突变变基基因因的的表表达达，或或者由蛋白过量表达引起的疾病。者由蛋白过量表达引起的疾病。第40页/共74页(二)、RNARNA干扰的发现 19941994年
27、 CogoniCogoni等证明真菌中亦有类似现象，此称为基因压制(quelling)(quelling)。共抑制现象(cosuppression)(cosuppression)上世纪9090年代初，美国和荷兰的两个转基因植物实验组在对矮牵牛(petuniaspetunias)的研究中发现:转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因也受到了抑制。第41页/共74页19951995年，康乃尔大学的Su GuoSu Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)(C.elegans)的par-1par-1基因实验中发现：反义RNARNA与正义RNARNA（对照）都能切断par-
28、1par-1基因的表达。该研究小组一直未能给这个意外以合理解释。Guo S,Kemphues KJ,Par L.Cell,1995,81:611-620.秀丽新小杆线虫转基因实验反义RNA与正义RNA？反义RNA-与靶核酸(如mRNA或有义DNA)链互补的RNA分子，可抑制靶核酸的功能。正义RNA-与mRNA对应的RNA分子。第42页/共74页RNARNA干扰的发现 19981998年，FireFire和MelloMello（美）首次在秀丽新小杆线虫中证明上述现象属于转录后水平的基因沉默。他们发现Su Su GuoGuo博士遇到的正义RNARNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNARNA技
29、术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNARNA中污染了微量双链RNARNA而引起：将体外转录得到的单链RNARNA纯化后注射线虫，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNARNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达，其抑制基因表达的效率比纯化后的反义RNARNA至少高2 2个数量级。该小组将这一现象称为RNARNA干扰。Fire A,Xu S,Montgomery ME,et al.Nature.1998,391:806-811.第43页/共74页(A)Negative control showing lack of staining in the absence of t
30、he hybridization probe.（对照，缺（对照，缺mex-3，不着色），不着色）(B)Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA(purple staining).（正常野生型，紫）（正常野生型，紫）(C)Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA.These embryos(and the parent animals)retain mex-3 mRNA,although levels m
31、ay be somewhat less than wild type.（野生型野生型+反义反义RNA，浅紫），浅紫）(D)Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3;no mex-3 RNA is detected.(Templates used for interfering RNA and in situ probes were largely non-overlapping.)（野生型（野生型+双链双链RNA，不着色），不着色）Effects of mex-3 RNA
32、interference on levels of the endogenous mRNA.Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization（原位杂交）of 4-cell stage embryos.第44页/共74页“沉默”是金Fire与Mello获2006年诺贝尔奖第45页/共74页在19991999年一年内,发现RNARNA干扰现象广泛存在于植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物细胞中。20002000年，又先后发现小鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也存在RNARNA干扰现象。20002000年提出R
33、NAiRNAi作用机制模型。Hannond SM et al.Nature,2000,404(6775):293-296Zamore PD.Cell,2000,101(1):25-3320012001年，RNAiRNAi技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉默现象。NatureNature，20012001，411411（68366836）：494494498498RNAiRNAi技术被ScienceScience评为20012001年度的十大科技进展之一。第46页/共74页20022002年5 5月，Lindenbach(Lindenbach(美),),双链RNARNA艾滋病病毒细胞减少艾滋病
34、病毒基因表达90%90%以上。20022002年7 7月,Novina,Novina等用RNAiRNAi技术实现了HIV1HIV1病毒的阻抑。20022002年7 7月,McCaffrey(McCaffrey(美)等人,双链RNA+RNA+肝炎病毒-标志基因鼠肝脏抑制标志基因的表达/肝炎病毒基因的表达。利用RNAiRNAi可以直接和有效地起到抗病毒的作用。第47页/共74页共抑制、基因压制和RNAidsRNA降解靶mRNA抑制靶基因的表达。均属于PTGS！dsRNA导入线虫RNAi；dsRNA注射线虫体腔RNAi；dsRNA浸润线虫/dsRNA的工程菌喂养线虫RNAi。dsRNA导入植物RNA
35、i；同样，dsRNA注射植物韧皮部RNAi；吸附500bp基因片段的金属片插入植物侵入点组织发生RNAi。RNAi普遍存在于各种生物中,具有抗病毒、稳定转座子及监控异常表达mRNA的生物学功能。第48页/共74页（三）、RNARNA干扰的机制 dsRNA：双链：双链RNA，包含正义链和反义链。，包含正义链和反义链。Dicer：属属于于RNase 家家族族的的一一员员，是是dsRNA的的特特异异性性核核酸酸内内切切酶酶，能能以以一一种种ATP依依赖赖的的方方式式逐逐步步切切割割由由外外源源导导入入或或者者由由转转基基因因、病病毒毒感感染染等等各各种种方方式式引入的双链引入的双链RNA。siRNA
36、(small interfering RNA)：小小干干扰扰RNA，是是长长度度为为21-23个个nt大大小小的的双双链链RNA，为为RNAi的的关关键效应分子。键效应分子。名词解释：第49页/共74页Dicer contains two RNAse III domainsDicer contains two RNAse III domainssiRNAslong dsRNA第50页/共74页siRNA第51页/共74页RISC(RNA-inducing silencing complex)：RNA诱导沉默复合物，是一种核蛋白复合物，具有核酸内切、外切以及解旋酶活性。RdRP（RNA-depe
37、ndent RNA polymerases）：依赖RNA的RNA聚合酶，是RNAi的调节因子，使RNAi可以在生物体内传递。第52页/共74页RISC:RNA-Induced Silencing ComplexRISC:RNA-Induced Silencing ComplexExonucleaseExonucleaseHomology search activityHomology search activityEndonucleaseEndonucleaseHelicaseHelicase53Target mRNATarget mRNAOH3OH35P5P核酸外切酶 解旋酶 核酸内切酶 第
38、53页/共74页dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程主要分为两步：第一步（起始阶段）较长dsRNA在ATP参与下，被RNase的特异核酸酶切割加工成2123nt的，由正义和反义链组成的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。siRNA的两条单链末端为5-磷酸和3-羟基，且3端均有2个突出的核苷酸。Dicer有解旋酶活性并含有 dsDNA结合域和PAZ结构域。Dicer的类似物相继在拟南芥、秀丽线虫及哺乳动物等机体中被发现。步骤第54页/共74页第二步（效应阶段）siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(
39、RNA-induced silencing complex，RISC)。活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降解，从而干扰基因表达。第55页/共74页RNAiRNAi的放大效应机制siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA，而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA。新合成的长链dsRNA同样可被RNase核酸酶切割、降解而生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成-切割的循环过程，进一步放大RNAi
40、作用。这种合成-切割的循环过程称为随机降解性PCR（random degradative PCR）。第56页/共74页Gisela Storz,Science,296(5571):1263-1265,2002.异常的单链RNA依赖RNA的RNA聚合酶特异性核酸内切酶RNA诱导沉默复合物第57页/共74页RNAi是转录后水平的基因沉默机制；是转录后水平的基因沉默机制；RNAiRNAi具有很高的特异性：具有很高的特异性：a.只有只有dsRNA才能诱导产生才能诱导产生RNAi；b.只有针对编码区的只有针对编码区的dsRNA才能产生有效的和特异性的干扰；才能产生有效的和特异性的干扰；c.注射同源注射同
41、源dsRNA可以引起内源性可以引起内源性mRNA特异性的降解；特异性的降解；d.d.dsRNAdsRNA不不得得短短于于2121个个碱碱基基，大大于于30bp30bp的的dsRNAdsRNA不不能能在在哺哺乳乳动动物物中中诱诱导导特特异异的的RNARNA干干扰扰，而而是是细细胞胞非非特特异异性性和和全全面面的的基基因因表达受抑制凋亡；表达受抑制凋亡；RNAi具有高效性具有高效性：RNAi抑抑制制基基因因表表达达具具有有很很高高的的效效率率，可可达达到到缺缺失失突突变变体体表表型型的的程程度度，而而且且相相对对很很少少量量的的dsRNA分分子子就就能能完完全全抑抑制制相相应基因的表达，这是通过催
42、化放大的方式进行的；应基因的表达，这是通过催化放大的方式进行的；RNAi干扰的几个重要生物学特征第58页/共74页RNAi具具有有很很好好的的稳稳定定性性：siRNA分分子子33端端有有突突出出的的非非配配对对碱碱基基的的双双链链分分子子，在在细细胞胞内内可可稳稳定定存存在在3-3-4d4d，以以33端端悬悬垂垂TTTT碱碱基基的的双双链链RNARNA尤尤为为稳稳定定，半半衰衰期期远远长长于于反反义义寡寡聚聚核核苷酸。苷酸。RNAi的的可可传传播播性性和和遗遗传传性性：RNAi抑抑制制基基因因表表达达的的效效应应可可以以长长距距离离传传递递和和维维持持信信号号甚甚至至传传播播至至整整个个有有机
43、机体体以以及及可可遗遗传给传给F1，但，但F2往往恢复为野生型。往往恢复为野生型。RNAi效效应应的的依依赖赖性性：只只有有连连续续产产生生dsRNA才才能能产产生生长长期期效应，否则只产生短暂的沉默反应。效应，否则只产生短暂的沉默反应。RNAi作用迅速，作用迅速，mRNA快速降解；快速降解；第59页/共74页miRNA及其作用机制miRNA(microRNA):微小RNA，指长度约2125nt的小分子单链RNA，位于基因组的非编码区，进化上高度保守，可在翻译水平上对基因表达进行调节的RNA家族。其介导的沉默机制也属于转录后的基因沉默。miRNA基因的表达具有特定模式:阶段特异性和组织特异性，
44、在不同组织中表达有不同类型的miRNA，在生物发育的不同阶段里有不同的miRNA 表达。第60页/共74页miRNA的作用机制第61页/共74页相同点相同点:长度都约长度都约22 nt 左右；左右；同是同是Dicer产物，因此具有产物，因此具有Dicer产物的特点；产物的特点；二者生成都需二者生成都需Argonaute 家族蛋白的存在；家族蛋白的存在；同是同是RISC的组分。的组分。miRNA与siRNA比较第62页/共74页来来源源不不同同：siRNA来来源源于于转转基基因因或或病病毒毒RNA，由由长长dsRNA转转变变而而来来；miRNA来来源源于于内内源源转转录录本本，是是细细胞胞内内R
45、NA的的固固有组分之一，由具有发夹状结构的有组分之一，由具有发夹状结构的pre-miRNA转变而来；转变而来；结结构构不不同同：siRNA主主要要以以双双链链形形式式存存在在，其其3端端存存在在2个个非非配对的碱基，通常为配对的碱基，通常为UU；miRNA主要以单链形式存在；主要以单链形式存在；对对靶靶RNA 的的特特异异性性不不同同：siRNA与与靶靶mRNA完完全全互互补补配配对对结结合合；miRNA与与靶靶RNA并并不不完完全全互互补补，存存在在错错配配现现象象。靶靶序序列列有有一一个个核核苷苷酸酸突突变变，就就会会影影响响到到siRNA的的作作用用功功能能，但但不会影响到不会影响到mi
46、RNA的功能；的功能；作作用用形形式式不不同同：siRNA主主要要在在转转录录后后通通过过降降解解mRNA发发挥挥作作用，而用，而miRNA只在蛋白质翻译水平上负调控靶基因的表达。只在蛋白质翻译水平上负调控靶基因的表达。不同点:第63页/共74页（四）、RNARNA干扰的研究方法 一般技术路线第64页/共74页（五）、RNARNA干扰的应用 1.基因功能研究由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰活力，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间
47、可以控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势，近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。第65页/共74页2.病毒性疾病的治疗 使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。某研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA，激发RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5（化介素受体，HIV-1的辅因子）进入人体外周淋巴细胞，而不影响另一种HIV-1主要的coreceptor-CCR4，从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内
48、产生了免疫应答，由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。艾滋病第66页/共74页2.病毒性疾病的治疗 Shlomai和Shaul设计了各针对HBV基因19nt的两种pSUPER载 体：pSUPER X-siRNA和 pSUPER core-siRNA。已转染含1.3 X wt HBV基因质粒载体的Huh7细胞再被 X-siRNA或 core-siRNA转染后，core蛋 白 水 平 分 别 降 低 了 89%、63%，转 染 X-siRNA的 细 胞 中 HBsAg降 低 60%，但 转 染 core-siRNA对HBsAg表达无明显影响（X-siRNA干扰沉默了所有的病毒转录
49、物，而core-siRNA仅沉默3.5kb、3.9kb的mRNA）。HBV（乙肝病毒）第67页/共74页2.病毒性疾病的治疗 Randall等证明了针对HCV RNA的siRNA转染细胞4天后可使细胞质中复制的HCV RNA降低80倍；将siRNA 转染至已有HCV感染、复制的细胞，siRNA对98%以上可检测到HCV抗原、HCV复制活跃的细胞有抑制作用；siRNA干扰沉默HCV RNA具有剂量依赖性和序列特异性。Kapadia等 也证明了siRNA特异抑制HCV RNA复制、阻止相关蛋白表达的作用。HCV（丙肝病毒）第68页/共74页2.病毒性疾病的治疗 RNAi还可应用于其它病毒感染如脊髓
50、灰质炎病毒等，siRNA已证实介导人类细胞的细胞间抗病毒免疫，用siRNA对Magi细胞进行预处理可使其对病毒的抵抗能力增强。严 重 急 性 呼 吸 综 合 征(severe acute respiratory syndrome，SARS)的防治研究，RNAi也受到了重视。siRNA在感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制，病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断，这些结果提示RNAi能胜任许多病毒的治疗。脊髓灰质炎病毒/SARS第69页/共74页3.肿瘤治疗 用RNAiRNAi特异性地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这类基因保持在静默或休眠状态，从而有望用这种新的