《无菌医疗器械检化验员培训微生物实验指导月页学习教案.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《无菌医疗器械检化验员培训微生物实验指导月页学习教案.pptx（107页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、无菌医疗器械检化验员培训微生物实验无菌医疗器械检化验员培训微生物实验(shyn)指导月指导月 页页第一页，共107页。微生物学(wi shn w xu)实验室规则 1.进实验室必须穿实验服，与实验无关的物品切勿(qi w)放在污染的实验台上。2.实验室内不准吸烟(x yn)、吃东西。3.实验室用过的带有微生物的吸管、玻片等应分别放在指定的消毒筒内。待消毒或废弃物品必须放在指定的地点。4.如有微生物污染桌面、地而、书和衣物等，应立即报告老师，并用0.1新洁而灭溶液处理半小时，或其他方法处理后洗净。5.如有活菌碰到手上应将手浸泡在0.1新洁而灭溶液510分钟，然后用自来水冲洗。6.实验过程中要爱护
2、器材，严格按操作规程实验，并遵守无菌操作。7.实验完毕，桌面应整理清洁，不可将火柴梗、擦镜纸投入水槽内、用过的物品归还原处（如接种环、染色液、擦镜纸、香柏油、火柴等），实验室打扫干净，关好水、电和窗。8.实验材料不得携带出实验室以免造成污染。9.用消毒液浸泡双手，再用自来水冲洗干净，脱去实验服，方得离开实验室。第1页/共107页第二页，共107页。无菌室要求(yoqi)无菌室空气净化级别（洁净环境(hunjng)内单位体积空气中含大于或等于某一粒径的悬浮粒子的允许统计数）为10000级，超净工作台的净化级别为100级。无菌室整体布局应合理，使用(shyng)操作方便，各功能间分区明确。应安装独
3、立的送排风系统以控制无菌室气流方向和压力梯度以确保在无菌室时气流由清洁区流向污染区，同时确保无菌室空气只能通过高效过滤后经专用排风管道排出。应保证整体通风换气次数不少于每小时6次。吊顶和地面等平整、防滑、无缝隙、易清洁、不渗水、耐化学品和消毒剂的腐蚀，常用的消毒剂有：75%酒精、过氧乙酸、新洁而灭等。核心区吊顶下方应安装紫外灯杀菌，可采用悬吊式紫外线灯（紫外线灯管功率：30W2、辐射紫外线波长：253.7nm、辐射度距灯管中心1米处：100W/cm2、消毒时间范围：0-120分钟）对室内空气进行消毒，开关控制应设在无菌室外走廊处。第2页/共107页第三页，共107页。微生物环境(hunjng)
4、控制相关标准 GB/T 16292:2010，医药工业洁净室(区)悬浮粒子(lz)测试方法 GB/T 16293:2010，医药工业洁净(jijng)室(区)浮游菌测试方法 GB/T 16294:2010，医药工业洁净(jijng)室(区)沉降菌测试方法 GB50073-2001洁净(jijng)厂房设计规范 ISO 14644-1:1999 洁净室及相关受控环境 第1部分：空气洁净度等级划分 ISO 14644-4:1999 洁净室及相关受控环境 第4部分：设计、施工、运行 ISO 14644-7:1999 洁净室及相关受控环境 第7部分：分离的设备第3页/共107页第四页，共107页。微生
5、物实验(shyn)控制1：环境控制第4页/共107页第五页，共107页。无菌室环境(hunjng)控制设备微粒(wil)计数仪第5页/共107页第六页，共107页。无菌室环境(hunjng)控制设备浮游(fyu)菌采样仪第6页/共107页第七页，共107页。无菌室环境控制(kngzh)设备第7页/共107页第八页，共107页。无菌室环境控制(kngzh)设备第8页/共107页第九页，共107页。洁净室沉降(chnjing)菌测试方法 1.测试(csh)时间 1.1对单向流，如100级净化房间(fngjin)及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10min后开始。1.2对非单向流，如1
6、0000级、100000级以上的净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min后开始。2.采样方法 将已制备好的培养皿按要求放置，打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5h，再将培养皿盖盖上后倒置。2.2.培养 全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。在3035培养箱中培养，时间不少于48h。每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。可每批选定3只培养皿作对照培养。第9页/共107页第十页，共107页。洁净室沉降(chnjing)菌测试方法 3.菌落(jnlu)计数 用肉眼直接计数，标记或在菌落(jnlu)计数器上点计，然后用510倍放大镜检查，有否遗漏。若培养皿上有2个或2
7、个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数。4.注意事项 4.1测试用具要作灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。4.2采取一切措施防止人为对样本的污染。4.3对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。4.4由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。4.5采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。第10页/共107页第十一页，共107页。洁净室沉降(chnjing)菌测试方法 5.测试(csh)规则 5.1.测试状态 5.1.1沉降菌测试(c
8、sh)前，被测试(csh)洁净室（区）的温湿度须达到规定的要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内。5.1.2沉降菌测试前，被测试洁净室（区）已经过消毒。5.1.3测试状态有静态和动态两种，测试状态的选择必须符合生产的要求，并在报告中注明测试状态。5.2.测试人员 5.2.1测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别的工作服。5.2.2静态测试时，室内测试人员不得多于二人。第11页/共107页第十二页，共107页。最少采样(ci yn)点数目面积(min j)1010202040401001002002004004001000100020002000100234816408016040080
9、0洁净度级别(jbi)100002224102040100200100000222236133263注：表中的面积，对于单向流洁净室.指的是送风面积；对非单向流洁净室，指的是房间面积第12页/共107页第十三页，共107页。同时(tngsh)满足最少平皿数洁净度级别(jbi)100级10000级100OOO级所需90mm培养皿数（以沉降(chnjing)0.5h计）1422第13页/共107页第十四页，共107页。采样(ci yn)点的布置 采样点的位置可以(ky)同悬浮粒子测试点。a）工作区采样点的位置离地0.8m1.5m左右(zuyu)（略高于工作面）。b）可在关键设备或关键工作活动范围处
10、增加采样点。采样点位置的详细规则见附录B（标准的附录）。第14页/共107页第十五页，共107页。采样(ci yn)点布置第15页/共107页第十六页，共107页。洁净度级别(jbi)沉降(chnjing)菌浮游(fyu)菌尘粒的最大允许数/m3个/（90mm）0.5h）活微生物数/m30.5m5m10015 3500100003100 350000 2000环境检测参照标准第16页/共107页第十七页，共107页。100微生物实验室管理(gunl)超净工作台级第17页/共107页第十八页，共107页。微生物实验室管理(gunl)严格(yng)区分污染区及清洁区第18页/共107页第十九页，共
11、107页。微生物实验控制2：人员(rnyun)管理第19页/共107页第二十页，共107页。相关(xinggun)标准 GB 15979-2002 一次性使用(shyng)卫生用品卫生标准(biozhn)GB 15980-1995 一次性使用医疗用品卫生标准 GB 15981-1995消毒与灭菌效果的评价方法和标准第20页/共107页第二十一页，共107页。微生物实验控制(kngzh)3：灭菌所有(suyu)器具应采用可靠方法灭菌 置压力(yl)蒸汽灭菌器内12130 min或 置电热干燥箱内1802 h。第21页/共107页第二十二页，共107页。湿热(sh r)灭菌仪器圆型压力(yl)蒸汽
12、灭菌器全自动压力(yl)蒸汽灭菌器第22页/共107页第二十三页，共107页。干热灭菌(mi jn)仪器烤箱烤箱电热(dinr)鼓风干燥箱第23页/共107页第二十四页，共107页。湿热灭菌控制相关(xinggun)标准 GB 18281.3-2000医疗保健产品灭菌(mi jn)生物指示物 第3部分(b fen):湿热灭菌用生物指示物 ISO 11138-3-2006医疗保健产品灭菌.生物指示物.第3部分:湿热灭菌用生物指示剂第24页/共107页第二十五页，共107页。微生物实验(shyn)控制4：培养基质量控制 灵敏度检查(jinch)（中国药典2010）无菌检查(jinch)（ISO11
13、737.2:2009或GBT19973.2-2005）第25页/共107页第二十六页，共107页。微生物实验控制(kngzh)5：无菌操作 定义：是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵入机体(jt)和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。无菌操作技术主要包括两方面：创造无菌的培养环境及在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入。创造无菌的培养环境包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌(mi jn)、培养基的灭菌(mi jn)等；防止一切其它微生物的侵入的措施包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、
14、操作工具、器皿灭菌(mi jn)、操作方法等。第26页/共107页第二十七页，共107页。微生物实验(shyn)前准备微生物实验控制1：环境控制微生物实验控制2：人员管理(gunl)微生物实验控制3：灭菌微生物实验控制4：培养基质量控制微生物实验控制5：无菌操作第27页/共107页第二十八页，共107页。实验(shyn)一：微生物基本操作琼脂平板(pngbn)接种法琼脂斜面接种法半固体接种法肉汤培养基接种法第28页/共107页第二十九页，共107页。琼脂(qingzh)平板接种法 细菌在自然界及人体中分布广，种类多，为了了解菌谱，须先将各种细菌分离，获得纯菌培养物后才能进一步作细菌的鉴定。琼脂
15、平板培养基因面积大，接种后可达到(d do)分离的目的，常称分离培养法。平板接种方法有多种。以下介绍平行划线法及分区划线法。第29页/共107页第三十页，共107页。琼脂(qingzh)平板接种法（分离培养法）平行(pngxng)划线法分区(fn q)划线法第30页/共107页第三十一页，共107页。琼脂平板(pngbn)接种法（分离培养法）第31页/共107页第三十二页，共107页。单个菌落(jnlu)第32页/共107页第三十三页，共107页。单个菌落(jnlu)第33页/共107页第三十四页，共107页。以平板划线为例与无菌操作(cozu)有关的环节1.2.3.4.5.6.7.8.9.1
16、0.点亮酒精灯并与之保持适当的距离；如何从无菌包内取出无菌平皿；培养基使用前如何确定它是否无菌；如何向平皿内倾注无菌培养基；平皿打开时间的控制；如何灼烧接种环；如何挑取菌落避免污染；如何在凝固的培养基内划线；如何在整个(zhngg)操作期间避免跨越无菌区；培养观察期间如何避免污染。第34页/共107页第三十五页，共107页。琼脂(qingzh)斜面接种法 目的：多用于纯种细菌的增菌和保存菌种 方法：用灭菌接种环取细菌培养物少许。拔去琼脂斜面培养基塞，管口经火焰上灭菌，将沾有细菌的接种环伸入管内，自下(z xi)而上在琼脂上蜿蜒划线；接种后，管口在火焰上灭菌，塞回塞，接种环灭菌：在试管口处做好标
17、记，置37培养1824小时第35页/共107页第三十六页，共107页。大肠杆菌(d chn n jn)斜面金黄色葡萄球菌(p to qi jn)斜面第36页/共107页第三十七页，共107页。肉汤接种(jizhng)法 目的(md)：用于增菌。方法：用灭菌(mi jn)接种环取细菌培养物少许；以无菌操作将沾有细菌的接种环伸入肉汤中，将环上细菌轻轻研磨于接近液面的管壁上，然后将试管稍倾斜，使肉汤碰及细菌即可；接种后管口灭菌(mi jn)，塞回塞，接种环灭菌(mi jn)，并做好标记，置37培养18-24小时第37页/共107页第三十八页，共107页。半固体(gt)接种法（穿刺接种法）目的(md)
18、：增菌和保存菌种；观察细菌有无动力。方法(fngf)：用接种针，将取有细菌的接种针自培养基中央刺入（不要接触管底），沿原穿刺线拨出，注意在刺入与拔出时不可晃动接种针；接种后做好标记。置37培养18-24小时第38页/共107页第三十九页，共107页。半固体(gt)琼脂培养基（0.5%）第39页/共107页第四十页，共107页。实验二：菌悬液制备(zhbi)（使用麦氏比浊管）麦氏比浊管：是McFarland发明的一种用于微生物比浊的不同浊度的标准浊度管。具体的配制方法是根据硫酸和氯化钡的比例(bl)来定的，有表可查，这样不同比例(bl)生成的硫酸钡沉淀的浓度不同，且都有定值。第40页/共107页
19、第四十一页，共107页。麦氏比浊管的配比(pi b)管 号(McFarland)0.5123450.25%BaCl2（ml）1%H2SO4(ml)0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.09.8 9.6 9.2 8.8 8.4 8.0细菌(xjn)的近似浓度(108/ml)13691215第41页/共107页第四十二页，共107页。123456786108 6107 6106 6105 6104 6103 6102 6101麦 氏 2 号 管 稀 释 梯 度 表（cfu/ml）第42页/共107页第四十三页，共107页。实验二：菌悬液制备（使用(shyng)分光光度仪）分光(fn un)光
20、度仪第43页/共107页第四十四页，共107页。菌悬液制备(zhbi)的保存 菌悬液制备：菌悬液制备后应在2小时内使用，若保存(bocn)在28的菌悬液可以在24小时内使用。黑曲霉也可制成稳定的孢子悬液保存(bocn)在28，在验证过的贮存期内替代对应量的新鲜孢子悬液使用。第44页/共107页第四十五页，共107页。培养基质量控制(kngzh)：灵敏度检查灵敏度检查所需的六种菌：金黄色葡萄球菌(p to qi jn)CMCC(B)26003 ATCC 6538铜绿假单胞菌 CMCC(B)10104 ATCC 9027枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 ATCC 6633生孢梭菌CMCC(B)
21、64941 ATCC 11437白色念珠菌CMCC(F)98001 ATCC 10231黑曲霉CMCC(F)98003 ATCC 16404 根据培养基的功能(gngnng)选择灵敏度实验所需菌种第45页/共107页第四十六页，共107页。明确规定：培养基灵敏度、微生物限度检查法检查所用的菌株传代次数不得(bu de)超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。培养基质量控制：灵敏度检查 中国(zhn u)药典2010年版第46页/共107页第四十七页，共107页。中国药典(yodin)2010年版在新增的“药品微生物实验室规范指
22、导原则”中对菌种有了较为明确的规定(gudng)：允许使用标准菌株和商业派生菌株 标准菌株应按保藏机构提供(tgng)的说明进行复活 标准储备菌株应进行纯度和特性确认 标准储备菌株建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存或超低温冷冻保藏的方法 标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株 冷冻菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用 工作菌株不可替代标准菌株，商业派生菌株仅可用作工作菌株培养基质量控制：灵敏度检查第47页/共107页第四十八页，共107页。菌株传代(chun di)基本概念 标准菌株：由国内或国际(guj)菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认(qurn)和保证并可追溯的菌株。（0代）标准
23、储备菌株：由标准菌株经一次传代得到的培养物。（1代）商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株。（2代）工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的培养物。（2代）代：将活的微生物接种到新鲜培养基中进行培养，并希望获取新的微生物培养物。这种操作方式，新培养物对接种培养物而言就称为一代。第48页/共107页第四十九页，共107页。工作(gngzu)菌种第3代工作(gngzu)菌种第3代工作(gngzu)菌种第4代工作(gngzu)菌液工作(gngzu)菌液第5代 第5代工作菌种第4代工作菌液工作菌液第5代 第5代制备工作菌种进行菌种保藏的模式图采购的第2代超低温冷冻标准储备菌种第49页/共
24、107页第五十页，共107页。各类菌种保藏条件(tiojin)及时间菌种细菌(xjn)酵母菌丝状真菌培 养 基一般多用于营养琼脂(qingzh)或根据菌种规定选用培养基一般用麦芽汁琼脂(qingzh)或麦芽汁酵母膏琼脂(qingzh)一般用PDA琼脂(qingzh)、蔡氏琼脂(qingzh)或麦芽汁琼脂(qingzh)等保存温度464646传 种 时 间芽孢杆菌36个月，其它细菌每个月一般46个月每4个月移植一次（每2个月移植一次）第50页/共107页第五十一页，共107页。菌 种 保 管菌种保管应有专人(zhunrn)负责，保存与加锁的冰箱中或特制的白铁箱中加锁置阴暗处，确保菌种安全。因工作
25、变动时，必须做好交接工作。菌种应有详细登记本，包括名称、分离日期、鉴定日期、鉴定者、主要鉴定性能，并注意记录使用、转移及销毁情况和原因。各种菌种应按规定时间定期移种。一般每移种3次后作一次全面鉴定。注意菌种有无污染和变异，如发现污染和变异时，应及时更换。购置菌种，应有介绍信。全部保存菌种应具备清单，并定期向部门负责人报告。第51页/共107页第五十二页，共107页。FTM 的 灵 敏 度 检 查培养(piyng)天数1 2 3 4 5培养基FTM(12ml)标 准 菌 种 (10-100cfu/ml)金黄色葡萄球菌緑脓杆菌枯草(k co)芽孢杆菌生胞梭菌空白对照3035培养(piyng)管1管
26、2管3管4管5管6管7管8管9第52页/共107页第五十三页，共107页。培养基质量控制(kngzh)：灵敏度检查接种金黄色葡萄球菌、緑脓杆菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂(qingzh)培养基中，3035培养1824h；用0.9%无菌氯化钠溶液制成10-100cfu/ml菌液备用。接种生胞梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐液体培养基中，3035培养1824h；用0.9%无菌氯化钠溶液制成10-100cfu/ml菌液备用。接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂(qingzh)培养基中，2328培养2448h；用0.9%无菌氯化钠溶液制成10-100cfu/ml菌液备用。接种黑曲霉的
27、新鲜培养物至改良马丁琼脂(qingzh)斜面培养基中，2328培养57d,加35ml0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成10-100cfu/ml孢子悬液备用。第53页/共107页第五十四页，共107页。菌种菌株传代次数培养基接种结果(ji gu)判断培养条件金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉；制备成活菌数100cfu的菌悬液备用不得超过5代每种菌接种至2管相应的培养基，另取一支不接种作空白对照，按规定温度(wnd)时间培养。空白对照管应无菌生长，每种菌接种后的2管培养基管均生长良好，该培养基的灵敏度
28、检查符合规定。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌接种至营养肉汤（或营养琼脂培养基）3035培养1824小时；生孢梭菌接种至硫乙醇酸盐流体培养基中3035培养3天；白色念珠菌、黑曲霉接种至改良马丁培养基中2328培养5天培养基质量(zhling)控制：灵敏度检查第54页/共107页第五十五页，共107页。培养基质量控制(kngzh)：无菌检查每批灭菌的培养(piyng)基随机取不少于5支(瓶)，培养(piyng)14天，应无菌生长。第55页/共107页第五十六页，共107页。实验(shyn)三：无菌实验(shyn)第56页/共107页第五十七页，共107页。无菌实验预防(yfng)假阳性
29、措施 1在一个专门准备、环境控制(kngzh)的房间内的层流罩的环境中进行(jnxng)测试 2在整个测试过程中使用无菌技术 3用避免污染的方法把测试器皿、培养基和测试物品引入测试区 4测试产品表面的细菌污染，在引导测试物品进入测试区之前，先对产品的外包装进行消毒。5对测试中使用的设备、材料和产品进行灭菌 6简化进行测试必须的操作 7尽量避免悬浮微粒的产生 8环境时时监测（沉降菌检测）第57页/共107页第五十八页，共107页。无菌实验相关(xinggun)标准 GBT19973.2-2005-医用器材的灭菌 微生物学方法(fngf)第二部分：确认灭菌过程的无菌试验 ISO 11737-2 2
30、009-医用器材(qci)的灭菌 微生物学方法 第二部分：确认灭菌过程的无菌试验第58页/共107页第五十九页，共107页。无菌实验：培养(piyng)条件 不论(bln)哪种无菌试验方法：FTM32.52.5，不少(b sho)于14天；SCDB22.52.5，不少(b sho)于14天；改良马丁23-28，不少于14天。如果14以内观察到阳性结果，不必继续培养。第59页/共107页第六十页，共107页。无菌实验(shyn)阳性对照 应根据供试品特性(txng)选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌
31、的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗霉菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。加菌量小于l00cfu，供试品用量同供试品无菌实验时每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养4872小时应生长良好第60页/共107页第六十一页，共107页。阴性(ynxng)对照 阴性对照：阴性对照供试品无菌实验时，应取相应(xingyng)溶剂和稀释同法操作作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。第61页/共107页第六十二页，共107页。无菌实验：结果(ji gu)判断 肉汤培养基有菌生长(shngzhng)的常见三种形式：混浊生长(shngzhng)：液体变混浊。菌膜：液体澄清，表面有一薄层菌膜。沉淀生长：液体澄清，管底有沉
32、淀物第62页/共107页第六十三页，共107页。混浊生长(shngzhng)：液体变混浊第63页/共107页第六十四页，共107页。肉汤培养基有菌生长的常见(chn jin)形式第64页/共107页第六十五页，共107页。无菌实验(shyn)：结果判断1.阳性对照管应生长良好(lingho)，阴性对照管应无菌生长2.培养期间逐日观察并记录是否有菌生长，如培养14天后，培养基出现浑浊，但不能确定是否有微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基或划线接种(jizhng)于斜面培养基上，细菌培养两天，霉菌培养三天，观察接种(jizhng)的同种新鲜培养基是否再出现浑浊或斜面是否有菌生长；或取培
33、养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。第65页/共107页第六十六页，共107页。实验(shyn)四 释出物检查Bacteriostasis/Fungistatic Test第66页/共107页第六十七页，共107页。无菌实验验证(ynzhng)：释出物检查 目的：对未知或可疑的供试品，在进行无菌试验实验前进行方法(fngf)验证试验，以确认供试品在该试验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计。第67页/共107页第六十八页，共107页。无菌实验验证：释出物检查 取灭菌产品(chnpn)以无菌操作转移到培养基中,30-35培养24hrs；注意：使用与实际无菌实验(shyn)同种等量的培养基 接
34、种(jizhng)每毫升浓度小于100cfu的菌种稀释液在无菌培养基内，一式两份，其中一份加入无菌试样，另一份作为阳性对照，并在合适的温度培养不超过5天。按表1所列菌种重复以上步骤。第68页/共107页第六十九页，共107页。实验组100cfu菌种对照组无菌样品(yngpn)释出物检查(jinch)无菌样品在合适的温度培养不超过5天。选择合适的微生物，重复(chngf)以上步骤。第69页/共107页第七十页，共107页。释出物检查(jinch)解释：通过与阳性对照对比，如果在培养容器内看不到微生物生长，则说明使用的样品能抑止细菌(xjn)或霉菌的生长。可以考虑使用无菌中和剂，如吐温80、卵磷脂
35、、偶氮植物(zhw)凝血素、-内酰胺酶。如果中和剂无效，增加培养基的量。尽量使用能使试验微生物生长的最小的培养基的量。第70页/共107页第七十一页，共107页。大豆(ddu)酪蛋白消化物培养基(SCDM)菌种培养(piyng)温度培养(piyng)条件培养时间枯草芽孢杆菌ATCC 6633白色念珠菌ATCC 1023122.52.5 22.52.5 需氧需氧3天3-5天释出物检查常用菌种第71页/共107页第七十二页，共107页。实验(shyn)四 初始污染菌Bioburden Test第72页/共107页第七十三页，共107页。定 义 生物负载(fzi)：一件产品和/或包装上存活的微生物总
36、数(zngsh)。生物负载(fzi)估计值：通过对活菌计数或灭菌前活菌计数加上一个回收效率补偿系数，得出的组成生物负载(fzi)的微生物数值。第73页/共107页第七十四页，共107页。初始(ch sh)污染菌相关标准 GBT19973.1-2005-医用器材的灭菌 微生物学方法 第一部分产品上微生物总数的估计(gj)ISO-11737-1:2006 GBT19973.1-2005-医用器材的灭菌 微生物学方法 第一部分产品上微生物总数的估计(gj)第74页/共107页第七十五页，共107页。样品份额取样(qyng)原则 1 定义：样品(yngpn)份额(SIP)sample item por
37、tion，即从某一保健产品单元(dnyun)上取出的用于试验的部分。2取样注意事项 2.1若可操作，试验应使用整个产品单元。但这往往被认为是不可行的，产品单元上的样品份额宜在实验室易于操作的前提下尽可能大。2.2如果所用的样品份额(SIP)小于一个完整的产品单元，则应选择代表产品单元的具有微生物的部分。如果已验证微生物在产品单元上是均匀分布的，应从产品单元上任一部位选择样品份额。在缺少这些验证的情况下，应从产品单元上随机选择几个部分作为样品份额。2.3样品份额本身应对产品单元内的产品有代表性。当产品分成不同的部分，可以分装于两个或多个容器内。样品份额可以根据供试产品单元的长度、质量、体积或表面
38、积。如果产品单元有标签说明只是液路无菌，宜把液路视为整个试验单位。(即SIP=1)2.4 SIP选择举例，见表1第75页/共107页第七十六页，共107页。表1 SIP 选择(xunz)举例选择(xunz)SIP的依据表面积质量标准(biozhn)样品放植物(非吸收)粉状、手术衣/单、植入物(可吸收)长度管路(直径不变)管路(直径不变)体积液路水、液体静脉输注器，液袋第76页/共107页第七十七页，共107页。微生物实验(shyn)仪器隔水式电热恒温(hngwn)培育箱漩涡(xun w)振荡仪第77页/共107页第七十八页，共107页。实验五 校正(jiozhng)因子Correction f
39、actor第78页/共107页第七十九页，共107页。校正(jiozhng)因子 定义：用于对活菌计数或灭菌(mi jn)前活菌计数进行修正的数值，以补偿产品上无法完全洗脱的微生物，以便计算出生物负载估计值。第79页/共107页第八十页，共107页。校正因子反复洗脱方法实验步骤 1取样品(yngpn)1件或sip，投入一定量的无菌洗脱液中(A)。2样品(yngpn)的处理采用旋涡混台器(2800次min)，振荡2min。3注皿：取处理洗脱液A2ml，分别注入两个无菌平皿中，每平皿1ml。4再洗脱:将样品(yngpn)从洗脱液A中取出沥干，移入另一定量的无菌洗脱液中(B)。5再处理:将B洗脱液置
40、旋涡混台器(2800次min)振荡2min。6再注皿:取B洗脱液2ml，分别注入两个无菌平皿内，每平皿lml。注：当微生物数少时,从B洗脱液开始，即可用无菌滤膜过滤后直接(zhji)放培养基中培养。7如此反复洗脱4次即A、B、C和D，直至洗脱累积量(初始(ch sh)污染菌)不再增加，最后沥干样品，将其平铺于无菌平皿中(E)。然后将熔化并冷至4548的NA培养基，分别注入AE各平皿每皿15ml。8待凝固后，放置在规定的培养条件下(3035，48h82h)培养，进行活菌计数。第80页/共107页第八十一页，共107页。校正(jiozhng)因子=1/0.3825=2.61编号琼脂覆盖总数回收率洗
41、脱(x tu)1洗脱(x tu)2洗脱3洗脱4平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均123800600700100080060030020020010002008522208 36.231605 37.381702 41.13平均38.25校正因子计算平皿均数稀释倍数第81页/共107页第八十二页，共107页。校正(jiozhng)因子计算 同批产品，需抽取3-5件，进行(jnxng)重复性试验，确定最小、最大及平均回收率和初始(ch sh)污染菌数。根据校正因子，灭菌前初始污染计数乘以校正因子即为产品带菌总数。第82页/共107页第八十三页，共107页。初始污染菌方
42、法(fngf)验证 检验洗脱液有无抑菌作用(y jn zu yn)检验样品有无抑菌作用(y jn zu yn)第83页/共107页第八十四页，共107页。无菌洗脱(x tu)液初始(ch sh)污染菌样品100cfu1.试验(shyn)组3.样品对照组初始污染菌方法验证（药典）菌种在3次独立的平行试验中:洗脱液对照组(4)的菌回收率应均不低于70%。（4/2）100试验组(1)的菌回收率应均不低于70%（1-3）/21002.菌液组4.洗脱液对照组100cfu/ml菌种无菌洗脱液初始污染菌样品无菌洗脱液100cfu菌种第84页/共107页第八十五页，共107页。初始污染(wrn)菌方法验证（I
43、SO11737）选用灭菌产品，如果洗脱技术中用到洗脱液，每一产品都应经受常规(chnggu)微生物洗脱技术，则将一定数量的易受破坏的微生物放人洗脱液中，回收微生物。选用灭菌产品，如果产品直接(zhji)放人培养基中，可以参照无菌实验的抑菌实验进行。第85页/共107页第八十六页，共107页。灭菌(mi jn)产品常规(chnggu)洗脱回收(hushu)细菌数100cfu菌种实验组回收细菌数/对照组菌数100702 对照组100cfu/ml菌种初始污染菌方法验证（ISO11737）1 实验组第86页/共107页第八十七页，共107页。微生物实验(shyn)仪器菌落计数仪第87页/共107页第八
44、十八页，共107页。微生物实验(shyn)仪器生化培养箱第88页/共107页第八十九页，共107页。微生物实验(shyn)仪器厌氧培养箱第89页/共107页第九十页，共107页。微生物实验(shyn)仪器烛 缸第90页/共107页第九十一页，共107页。微生物实验(shyn)仪器恒温(hngwn)振荡培养箱第91页/共107页第九十二页，共107页。微生物实验(shyn)仪器-80低温冰箱第92页/共107页第九十三页，共107页。微生物实验(shyn)实验(shyn)前实验(shyn)中 实验后环境控制人员控制灭菌控制培养基质量无菌操作方法验证无菌实验B/F初始污染菌验证洗脱液验证样品无抑菌
45、作用灵敏度实验无菌检查仪器校正简化操作沉降菌检测第93页/共107页第九十四页，共107页。实验(shyn)七 革兰氏染色第94页/共107页第九十五页，共107页。革兰氏染色(rns)步骤 涂片：用纱布擦净玻璃片，以无菌接种环取一小滴无菌生理盐水，然后用无菌接种环挑取少数(shosh)菌苔（落）或液体培养基培养物（不必加盐水），在玻璃片中央涂成一薄膜。干燥(gnzo)：涂片后放室温中自然干燥(gnzo)。固定：将玻片迅速通过火焰3次（其目的是杀死细菌），使菌体与玻片粘附牢固，以及改变对染料的通透性。初染：滴加结晶紫染液于已固定的玻片上，染1min，水洗。媒染：滴加碘液，作用1min，水洗。脱
46、色：加95酒精于涂片上，轻轻摇动78次，使均匀脱色至涂面无紫色或稍成淡紫色，立即水洗。复染：用石炭酸复红稀释液染0.5min，水洗，用滤纸吸干。于涂片上滴加少许香柏油，镜检。第95页/共107页第九十六页，共107页。革兰氏染色(rns)：镜检 镜检：用油镜观察标本时，先以低倍镜对光(du gung)，光线宜强，并开大光圈升高集光器。从侧面转动选择油镜头，将油镜头浸于涂片油内，然后由目镜中观察物象，观察时可先调粗调节器，当看到物像时，再旋转细调节器，直至物像清晰为止。结果：菌体呈紫色者为革兰阳性；呈红色(hngs)者为革兰阴性。（注：显微镜是较贵重的仪器设备，宜轻巧操作，并按说明书规定的方法使
47、用和保养。油镜是显微镜中最宝贵的部分，用后一定要立即用擦镜纸拭去油渍。若油干涸，可用二甲苯少许涂于擦镜纸上，擦去油，并将物镜转换成八字形，存放于箱内。）第96页/共107页第九十七页，共107页。实验八 物体表面细菌(xjn)总数第97页/共107页第九十八页，共107页。物体(wt)表面细菌总数 方法：将内径(ni jn)为5cm5cm的灭菌规格板，放在被检物件体表面，根据物体表面积大小，采平行样l4个，用浸有灭菌生理盐水的棉拭子，在规格板内涂抹10次（往返计为1次），将棉拭子放入l0ml灭菌生理盐水的采样管中。第98页/共107页第九十九页，共107页。物体(wt)表面细菌总数 将每个采样
48、管震打80次，混匀，10倍递减稀释，每个稀释度（取3个稀释度）分别取1ml放于灭菌培养皿（每个稀释度倾注(qngzh)2块平板），用普通琼脂培养基作倾注(qngzh)培养，置37温箱培养24h,观察结果，取菌落数为30300的培养皿计算，求出平均菌落数。菌数（cfu）/cm2=平均(pngjn)菌数稀释倍数/采样面积（cm2）第99页/共107页第一百页，共107页。实验(shyn)九 生产人员手细菌总数第100页/共107页第一百零一页，共107页。生产人员(rnyun)手细菌总数 方法：被检人五指并拢，将浸有灭菌生理盐水的棉拭子在右手指曲面，从指尖、甲沟至指根处往返涂抹(tm)10次后，将
49、棉拭子放入10ml灭菌生理盐水的试管中。第101页/共107页第一百零二页，共107页。生产人员(rnyun)手细菌总数 将每个采样(ci yn)管震打80次，混匀，10倍递减稀释，每个稀释度（取3个稀释度）分别取1ml放于灭菌培养皿（每个稀释度倾注2块平板），用普通琼脂培养基作倾注培养，置37温箱培养24h,观察结果，取菌落数为30300的培养皿计算，求出平均菌落数。菌落数（cfu）/每只手=平均菌数稀释倍数第102页/共107页第一百零三页，共107页。平皿计数(j sh)法计数(j sh)原则 1.先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状
50、菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半(ybn)，而其余的一半(ybn)菌落分布又很均匀时，则可将此一半(ybn)的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。2.首先选择平均菌落数在30300之间的，当只有(zhyu)一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为细菌总数(见例1)。3.若有两个稀释度的平均菌落数均在30300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数(见例2及例3)。第103页/共107页第一百零四页，共107页。平皿计数(j sh)法计数