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1、动物细胞培养发展史1885年，Roux用温生理盐水培育鸡胚组织。1887年，培养皿由在德国生物学家罗伯特科赫手下工作的细菌学家朱利斯理查德佩特里于1887年设计，故也称为“佩特里皿”。是一种用于细胞培养的实验室器皿，由一个平面圆盘状的底和一个盖组成，一般用玻璃或塑料制成。1906年，Beebe和Ewing用盖片悬滴培养法，以动物血清做培养基，培养狗淋巴细胞存活了72小时。现代细胞培养是从Harrison和Carrel两人开始的。Harrison参考前人经验，创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法。1907年，哈里森(Harrison)在无菌条件下用淋巴液作培养基，培养蛙胚神经组织存活数周，并观察到神
2、经细胞突起的生长过程，由此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，奠定了动物组织体外培养的基础。19101912年，Carrel采用无菌操作、更新培养基、传代，完善了悬滴培养法。1915年，昆虫细胞培养的鼻祖是德国人Bendict，发表了有关昆虫细胞培养的第一篇文章。1923年，Carral设计创立了卡氏瓶培养法，用此法可根据需要随时更换培养液，既有利于组织不断生长，又可以运用不同种类的营养液培养不同的细胞，极大地推动了当时组织培养研究。在培养基方面，Earle在1948年设计了含有碳酸氢钠等盐类的Earle氏盐溶液，Hanks在1949年设计了Hanks氏盐溶液。Earle、Dulbecco等于1
3、943年创建单层细胞培养法，首建长期传代的L-细胞系。1948年Sanford创建单细胞分离培养法，获L-细胞纯系。1948年，体外细胞毒性试验细胞毒性实验它是利用体外细胞培养的方法，测定细胞溶解，抵制细胞生长的毒性作用来评价生物材料的潜在细胞毒性。1948年，RosenBluth等首次报道利用鼠成纤维细胞培养来筛选聚合物，开始了细胞毒性试验评价生物材料的生物相容性的研究与应用工作。1950年，Enders及其同事发表了第一篇关于在培养细胞中生长病毒的报告，开拓了以动物病毒为研究对象的新领域。作为大规模细胞培养，Copsik等人成功得进行了有关仓鼠肾细胞（BHK）的悬浮培养。1951年，Dul
4、becco等采用胰蛋白酶消化组织培养法，获得了单层细胞培养，并开始应用人工合成培养液。随着抗生素的普遍应用，体外培养细胞已经是分离、鉴定和大量培养病毒的简便而又十分有效的工具。1951年，Gey首建人肿瘤细胞Hela细胞系。1952年，水痘带状疱疹是由一种DNA病毒即水痘带状疱疹病毒（VZV）感染引起，该病毒1952年由Weller等首先通过细胞培养获得 。1954年，Peebles采自麻疹病人的材料进行人的肾脏细胞培养，从而成功地分离到病毒。乙醚易使病毒钝化。用人细胞、猴肾等作为第一代培养的细胞，再以Hela细胞等的株细胞进一步增殖，并可在鸡胚的羊膜和绒毛尿囊膜上进行减毒增殖。1955年，恩
5、德斯（Enders）发表了用组织细胞培养分离麻疹病毒成功的报告。中国第一代医学病毒学家汤飞凡认为这是病毒方法学的一个突破，必须尽快掌握它。1955年，他就领导闻仲权开始建立了人胚和猴肾细胞的组织培养。1956年，支原体是一种能营独立生活的最小微生物，它没有坚韧的细胞壁，故其形态有较大的可塑性，容易通过细菌滤器，是动物细胞系长期培养中常见的污染源。1956年，由Robison首次从体外细胞培养物中分离出支原体。1957年Dulbecco实验室采用胰蛋白酶消化处理，使成块的组织分散成单个细胞，进行悬液培养，从而开创了细胞培养技术。用单层细胞培养法可以建立很多细胞系，通过单细胞分离培养法又可建立克隆
6、细胞株。1958年，狂犬病毒适应于在细胞培养中增殖，随后利用该技术生产的细胞培养疫苗在安全性和效力上都日臻完善。1958年，陈善明先生等老一辈科学家带领科研人员根据新疆地区的资源特点，首先开展了动物病毒学的研究，为新疆生物化学的研究开创了局面。利用兔肾、牛肾、羊肾和鸡脾等原代单层细胞，进行口蹄疫病毒的研究。采用兔肾细胞培养出的A型系口蹄疫苗，深受牧区广大牧民的欢迎。1958年，日本科学家岗田用灭活的仙台病毒诱导人的腹水癌细胞融合成功。后来科学家们又成功地诱导了不同种动物的体细胞融合，并且能将杂种细胞培养成活。随着细胞融合技术的不断改进，现在这项技术已经广泛应用于细胞学、遗传学、免疫学、病毒学等
7、多种学科的研究工作中。1959年，美国M.Klein 等用牛肾细胞培养物最先分离到腺病毒，其抗原结构类似于人腺病毒。1960年，人的外周血淋巴细胞培养方法是1960年由Moorhead 提出来的。正常情况下，人外周血小淋巴细胞都处在G1期（或G0期），但在体外给予一定的条件，进行培养，经72h就可获得大量的有丝分裂细胞。这种取材简易、用血量少的培养方法已被广泛采用。1961年，Hayflick首建人二倍体细胞系25种，开辟了应用新方向。1963年，进行了单细胞克隆。原始的细胞株是成纤维细胞，贴壁依赖性。但后来经无数次传代后细胞可悬浮生长，它广泛用于增殖各种病毒，生产兽用疫苗。1965年，有学者
8、在进行鱼类细胞培养时，首次发现鱼类细胞能够分泌类似哺乳类IFN的抗病毒活性物质，之后陆续发现多种鱼类机体和体外培养细胞均能诱生出IFN。1966年，Steele和Breg成功的进行了羊水细胞培养及胎儿核型分析之后，使羊膜腔穿刺术广泛地应用于胎儿染色体疾病及先天性代谢病的产前，随后此方法开始广泛应用于胎儿疾病的产前诊断。1967年，Mancini和Yates在鸡胚脑细胞培养中首次成功繁殖了AEV的VR株。随后鸡胚成纤维细胞、肾细胞、神经胶质细胞和雏鸡胰细胞也被用于病毒适应株和野毒株的培养，病毒滴度，特别是自然毒株，一般较低，且未见细胞病变。1967年，HyClone实验室创建，从为美国大学基础研
9、究中的细胞培养开发高质量的胎牛血清做起，HyClone最先使用科学的收集方法和生产工艺生产出了内毒素和血红蛋白含量极低的高品质血清。第一个使用了高效过滤方法，大大地提高了胎牛血清（FBS）的质量和促生长特性。1975年，角质形成细胞体外培养技术是在Rheinwald 和Green于1975年创立的饲养层细胞培养方法的基础上逐渐发展起来的。1975年，Sato成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株CH4，还有人用HamF12无血清细胞培养基成功地克隆了中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）。1976年，Van Wezel首次报道使用微载体培养动物细胞，创立了生物反应器微载体培养细胞工艺，使动物细胞培养进入
10、高密度培养阶段。1977年，Dexter创立了骨髓细胞长期培养，可支持粒系血细胞的分化和成熟。1979年，Provost首次在体外培养成功后，甲型肝炎病毒（HAV）可用多种原代及传代细胞株分离培养，如非洲绿猴肾细胞、人胚肾细胞、传代猴肾细胞（Vero、BSC- 1、FRhK-4）以及人二倍体肺细胞株（MRC5、KMB17）等。1982年，Fridenshtein等发现并建立了以贴壁培养法为主要手段的分离扩增方法。1983年，英国Wellcome公司就能够利用5000L的细胞罐进行大规模细胞培养生产口蹄疫疫苗；美国Genentech公司应用SV40为载体，将乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳动物细
11、胞内进行高效表达生产出乙型肝炎疫苗。1987年，国外有人把培养的黑素细胞开始用于临床。利用黑素细胞培养技术，可以把少量皮肤组织扩增培养出大量黑素细胞。有人用来治疗白癜风等疾病，疗效满意，前景很好。但是由于黑素细胞常用培养基中含佛波醇酯（TPA），存在致瘤危险，影响了这种方法在临床的应用。1988年，Hofmann 等首次在培养基含胰酶的Vero细胞上成功繁殖出猪流行性腹泻病毒（PEDV），此后，该方法在PEDV的分离、细胞培养和疫苗的研究中广泛应用。1999年，刘勇等成功地进行了胎儿椎间盘细胞的单层培养。目前，国内外进行椎间盘细胞单层培养的实验研究较多，技术方法已经成熟。在悬浮细胞流加培养工艺
12、方面，美国麻省理工Xie Liangzhi等人2000年报道在2L生物反应器中流加培养杂交瘤细胞，通过营养控制降低氨和乳酸的比生成速率，补充培养基包括营养成分、胎牛血清和含量极少的金属，最大活细胞密度达到1.7107cells/mL。2001年，美国Ohashi、Ryo等人报道采用2L一次性生物反应器灌注培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。2001年，瑞士Heine、Holger等人用带超声细胞分离器(UCS)的连续灌注搅拌罐生物反应器培养鼠杂交瘤细胞生产单克隆抗体。2005年，在新华奶牛场降生的被导入人乳铁蛋白基因的体细胞克隆牛耳朵成纤维细胞，经过细胞培养、克隆、胚胎培养和移植等技术实现的。经相关
13、技术鉴定，确系转基因体细胞克隆牛的再克隆体。此次实验的妊娠率、出生率、存活率等均达到世界一流水平。2007年11月，成功地用人类皮肤细胞培养出了诱导性多功能干细胞。由于这项研究解决了胚胎干细胞研究所面临的伦理问题，因此将彻底改变干细胞研究的科学与政策，为生物医学研究开辟新的方向。2008年9 月13日，日本京都大学日前宣布，该校教授山中伸弥开发的诱导多功能干细胞（iPS细胞）培养方法已被日本特许厅（相当于专利局）授予专利，成为世界首个获得批准的iPS 细胞相关专利。2010年，来自美国Wake Forest大学Baptist医学中心再生医学研究所的研究人员，利用人类肝细胞成功制造出像人类肝脏一
14、样在实验室条件下功能齐全的微型肝脏。例. 科学家将人体皮肤细胞改造成了多能干细胞“iPS细胞”，人类“iPS细胞”可以形成神经元等人体多种组织细胞。以下有关说法正确的是（ ）A.iPS 细胞分化为神经细胞的过程体现了细胞的全能性B.iPS 细胞有细胞周期，它分化形成的神经细胞一般不具细胞周期C.iPS 细胞可分化形成多种组织细胞，说明“iPS细胞”在分裂时很容易发生突变D.iPS 细胞可分化成人体多种组织细胞，是因为它具有不同于其他细胞的特定基因解析：iPS细胞分化为神经细胞，但没有发育为完整个体，所以没有体现了细胞的全能性，A错误；iPS细胞能进行分裂分化，所以有细胞周期，它分化形成的神经细胞不再分裂，所以一般不具细胞周期，B正确；iPS细胞可分化只是基因选择性表达，遗传物质不发生改变，C错误；iPS细胞可分化成人体多种组织细胞，是因为它具有发育为完整个体的全套基因，D错误。故答案为B。学科网（北京）股份有限公司