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1、基因工程第三章操作技基因工程第三章操作技术第1页，本讲稿共23页六六.Differentramificate(衍生的）衍生的）methodsofPCR1、热启动、热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方特异性最重要的方法之一。法之一。原因：尽管原因：尽管TaqDNA聚合酶的最佳延伸温度在聚合酶的最佳延伸温度在72，聚合酶在，聚合酶在室温仍然有活性。因此，室温仍然有活性。因此，PCR反应体系配制过程中，以及在热循环反应体系配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异
2、性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。异性产物一旦形成，就会被有效扩增。对策：对策：v限制限制TaqDNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，反应液，并将其置于预热的并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。第2页，本讲稿共23页v热启动通过抑制一种基本成分延迟热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到合成，直到PCR仪达到变性温度。仪达到变性温度。包括包括延缓加入延缓加入TaqDNA
3、聚合酶聚合酶;使用使用蜡防护层蜡防护层将一将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开物理地隔离开。在热循。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起起;聚合酶的活性需经过聚合酶的活性需经过9510mins的高温造成的高温造成化学修饰基团的脱落，然后才有聚合的活性化学修饰基团的脱落，然后才有聚合的活性.第3页，本讲稿共23页2、Touch-downPCRTouch-downPCR又称降落又称降落PCR。即选定一个温度范。即选定一个温度
4、范围，如围，如6550，每降，每降1-2进行进行1-2个循环，然后个循环，然后在在50度下进行度下进行15个循环。个循环。Touch-down的原理：随着退火温度的降低，特异的原理：随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。降低，特异性条带优先被扩增。选择初始复性温度的原则：起始复性温度应该比引选择初始复性温度的原则：起始复性温度应该比引物的物的Tm值高出值高出5-10度，然后每个循环递减度，然后每个循
5、环递减1-2度度第4页，本讲稿共23页Touch-downPCR的应用范围的应用范围vlow copy of targeted DNA;vhigh degree degeneracy(or less specific)of the set of primers;vRT-PCR using oligo-dT.第5页，本讲稿共23页3、巢氏、巢氏PCR（NestedPCR）v巢氏巢氏PCR需要两到三对引物，一般采用第一套引物扩增需要两到三对引物，一般采用第一套引物扩增15-30个循环，再用扩增个循环，再用扩增DNA片段内设定的第二套引物扩增片段内设定的第二套引物扩增15-30个循环，这样可使待扩增
6、序列得到高效扩增，而次级序列个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增，而次级序列却很少扩增。套式引物却很少扩增。套式引物PCR减少了引物非特异性退火，从而减少了引物非特异性退火，从而增加了特异性扩增，提高了扩增效率。增加了特异性扩增，提高了扩增效率。v若将巢氏若将巢氏PCR的内外引物稍加改变，延长外引物长度（的内外引物稍加改变，延长外引物长度（25-30bp），同时缩短内引物长度（），同时缩短内引物长度（15-17bp），使外引物先在高），使外引物先在高退火温度下复性，做双温扩增，使内引物在外引物扩增的基础退火温度下复性，做双温扩增，使内引物在外引物扩增的基础上，在低退火温度复性，直到扩增完成，
7、这样就可以使两套引上，在低退火温度复性，直到扩增完成，这样就可以使两套引物一次同时加入。物一次同时加入。第6页，本讲稿共23页4、原位PCRv原位原位PCR就是在组织细胞里进行就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术.v原位原位PCR是是Hasse等于等于1990年建立的，实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、年建立的，实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织
8、、脱落细胞、血细胞等血细胞等.v其基本方法为其基本方法为固定细胞固定细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，灭活除去细胞内源性过氧化物酶灭活除去细胞内源性过氧化物酶.蛋白酶蛋白酶K消化处理消化处理:用用60ug/ml的蛋白酶的蛋白酶K将固定好的组织细将固定好的组织细胞片胞片55消化处理消化处理2h后，后，962min以灭活蛋白酶以灭活蛋白酶K.PCR扩增扩增:在组织细胞片上，加在组织细胞片上，加PCR反应反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属
9、板上，进行PCR循环扩增循环扩增.有的基因扩增仪带有的基因扩增仪带有专门用于原位有专门用于原位PCR的装置的装置.杂交杂交:PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交.显微镜观察结果显微镜观察结果.v原位原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值.其特异性和敏其特异性和敏感性高于一般的感性高于一般的PCR.第7
10、页，本讲稿共23页第8页，本讲稿共23页6、免疫、免疫-PCR(immuno-PCR)v免疫免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一种灵敏、特异的抗原检测系是新近建立的一种灵敏、特异的抗原检测系统统.它利用抗原它利用抗原-抗体反应的特异性和抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性来检测扩增反应的极高灵敏性来检测抗原，尤其适用于极微量抗原的检测抗原，尤其适用于极微量抗原的检测.v免疫免疫-PCR试验的主要步骤有三个试验的主要步骤有三个:抗原抗原-抗体反应，抗体反应，与嵌与嵌合连接分子结合，合连接分子结合，PCR扩增嵌合连接分子中的扩增嵌合连接分子中的DNA(一般为质粒一般为质粒DN
11、A).该技术的关键环节是嵌合连接分子的制备该技术的关键环节是嵌合连接分子的制备.在免疫在免疫-PCR中，中，嵌合连接分子起着桥梁作用，它有两个结合位点，一个与抗原抗嵌合连接分子起着桥梁作用，它有两个结合位点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与质粒体复合物中的抗体结合，一个与质粒DNA结合，其基本原理与结合，其基本原理与ELISA和免疫酶染色相似，不同之处在于其中的标记物不是酶而和免疫酶染色相似，不同之处在于其中的标记物不是酶而是质粒是质粒DNA，在操作反应中形成抗原抗体，在操作反应中形成抗原抗体-连接分子连接分子-DNA复合物，复合物，通过通过PCR扩增扩增DNA来判断是否存在特异性抗原
12、来判断是否存在特异性抗原.v免疫免疫PCR优点为优点为:特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础上性反应的基础上.敏感度高，敏感度高，PCR具有惊人的扩增能力，免疫具有惊人的扩增能力，免疫PCR比比ELISA敏感度高敏感度高105倍以上，可用于单个抗原的检测倍以上，可用于单个抗原的检测.操操作简便，作简便，PCR扩增质粒扩增质粒DNA比扩增靶基因容易得多，一般实验室比扩增靶基因容易得多，一般实验室均能进行均能进行第9页，本讲稿共23页v自从自从1988年，年，Chamberlain研究表明研究表明PCR可以同可以同时扩增人类肌营养不良蛋白基因多个基因
13、座以来，时扩增人类肌营养不良蛋白基因多个基因座以来，多重多重PCR技术得到研究人员的广泛关注，并且已技术得到研究人员的广泛关注，并且已经逐渐发展成为一种通用技术。如今，多重经逐渐发展成为一种通用技术。如今，多重PCR技术已经广泛的应用于病原体鉴定、性别筛选、技术已经广泛的应用于病原体鉴定、性别筛选、连锁分析、法医研究、模板定量和遗传疾病诊断连锁分析、法医研究、模板定量和遗传疾病诊断之中。之中。7、多重PCR第10页，本讲稿共23页v多重多重PCR（multiplexpolymerasechainreaction，MPCR）也称为复合）也称为复合PCR，是在常规，是在常规PCR的基础之上进行改进
14、从而发展起来的一种新的基础之上进行改进从而发展起来的一种新型的型的PCR扩增技术，多重扩增技术，多重PCR技术的基本原理与技术的基本原理与常规的常规的PCR技术相同。技术相同。v多重多重PCR技术主要有两种形式：一、将多条引物技术主要有两种形式：一、将多条引物和多个模板和多个模板DNA混合在同一个反应体系中分别特混合在同一个反应体系中分别特异扩增不同的目的条带，常用于突变缺失检测、异扩增不同的目的条带，常用于突变缺失检测、多态分析等；二、将多条引物和单一的模板多态分析等；二、将多条引物和单一的模板DNA混合在同一反应体系中扩增同一模板的不同片段，混合在同一反应体系中扩增同一模板的不同片段，常用
15、于对超长片段的扩增。常用于对超长片段的扩增。第11页，本讲稿共23页v多重多重PCR的优点：的优点：高效性，在同一高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，且所需模板或样品量极少，应用一滴血或对有多个型别的目的基因进行分型，且所需模板或样品量极少，应用一滴血就可检测多种病原体。就可检测多种病原体。系统性，多重系统性，多重PCR很适宜对症状相同或容易污染相同很适宜对症状相同或容易污染相同食品的一组病原菌进行分析，即适宜对成组病原体进行检测，如肝炎病毒，肠食品的一组病原菌进行分析，即适宜对成组病原体进行检测，如肝炎病毒，肠
16、道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时检测道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时检测经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床或食品安全检测提供更多更准确的诊断信息。试剂，节约经费开支，为临床或食品安全检测提供更多更准确的诊断信息。v多重多重PCR的不足：的不足：灵敏性和检测的特异性低灵敏性和检测的特异性低需要优先扩增某一特定片段需要优先扩增某一特定片段容易形成引物二聚体。多重容易形成引物二聚体。多重PCR要求不同的引物能在同一
17、反应体系中进行各要求不同的引物能在同一反应体系中进行各自的特异性扩增，但是它的体系建立和条件优化过程需要较长的时间，所以在自的特异性扩增，但是它的体系建立和条件优化过程需要较长的时间，所以在一定程度上限制了该方法的推广应用。一定程度上限制了该方法的推广应用。第12页，本讲稿共23页v面临的问题：面临的问题：在多重在多重PCR的反应体系中，由于涉的反应体系中，由于涉及到的引物比较多，因此比较容易造成引物二聚及到的引物比较多，因此比较容易造成引物二聚体、错配和非特异性扩增等现象，从而降低扩增体、错配和非特异性扩增等现象，从而降低扩增反应的效率。所以在建立一个多重反应的效率。所以在建立一个多重PCR
18、反应体系反应体系的时候，需要对设计的引物，反应体系的组成和的时候，需要对设计的引物，反应体系的组成和PCR循环条件等进行反复的摸索，并进行优化。循环条件等进行反复的摸索，并进行优化。第13页，本讲稿共23页8.反向反向PCR：v常规常规PCR只能扩增两个引物之间的只能扩增两个引物之间的DNA区段，但有区段，但有时我们想知道基因之外的两侧未知时我们想知道基因之外的两侧未知DNA序列，这样序列，这样就出现了反向就出现了反向PCR。v反向反向PCR首先将首先将DNA用限制性内切酶切割，切割要用限制性内切酶切割，切割要保持已知序列两端有未知序列，进行环化，然后用保持已知序列两端有未知序列，进行环化，然
19、后用引物进行扩增。产物是已知序列以外的序列。引物进行扩增。产物是已知序列以外的序列。第14页，本讲稿共23页9.PCRRFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)v是一种借助于限制性内切酶对是一种借助于限制性内切酶对PCR扩增片断进扩增片断进行酶切分析的方法。用于鉴定分类。行酶切分析的方法。用于鉴定分类。v基因有保守区，有可变区，我们可以依据保守区设基因有保守区，有可变区，我们可以依据保守区设计共同的引物，然后用酶进行酶切分析，不同的物计共同的引物，然后用酶进行酶切分析，不同的物种的酶切分析图不同，这种图谱也叫指纹图谱。种的酶切分析图不同，这种图谱也叫
20、指纹图谱。可变可变保守第15页，本讲稿共23页10.PCR定点诱变：定点诱变：v法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过扩增而获得定点突变的基因或变引物，通过扩增而获得定点突变的基因或片段。片段。PCR定点诱变法可分为重组定点诱变法可分为重组PCR定定点诱变法和大引物诱变法两种。点诱变法和大引物诱变法两种。第16页，本讲稿共23页第17页，本讲稿共23页第18页，本讲稿共23页第19页，本讲稿共23页四、脉冲电场凝胶电泳（四、脉冲电场凝胶电泳（PFGE）第20页，本讲稿共23页第21页，本讲稿共23页第22页，本讲稿共23页第23页，本讲稿共23页