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1、微生物实验培养基的制备和消毒灭菌农学第1页，本讲稿共18页（二）原理：（二）原理：培养基培养基是按照微生物生长繁殖或积累代谢是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需的各种营养物质，用人工方法配制而产物所需的各种营养物质，用人工方法配制而成的一种基质。它包括碳源、氮源、生长因子、成的一种基质。它包括碳源、氮源、生长因子、无机盐和水等营养要素。无机盐和水等营养要素。由于不同微生物细胞组成不同，因而所需由于不同微生物细胞组成不同，因而所需营养基质不同，为了分离、培养和鉴定不同的营养基质不同，为了分离、培养和鉴定不同的微生物，必须根据其需要，配制合适的培养基。微生物，必须根据其需要，配制合适的培养基。第
2、2页，本讲稿共18页培养基的制备原则：培养基的制备原则：1.根据不同微生物的营养需要配置不同的培养基。根据不同微生物的营养需要配置不同的培养基。2.调配好培养基营养成分的浓度和比例。调配好培养基营养成分的浓度和比例。3.控制微生物的培养条件（渗透压、控制微生物的培养条件（渗透压、pH、氧化还原、氧化还原电位等）电位等）细菌细菌 牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨放线菌放线菌 高氏高氏1号号真菌真菌 查氏、马丁氏查氏、马丁氏各类各类M 土豆葡萄糖土豆葡萄糖第3页，本讲稿共18页（三）器材：（三）器材：1.药品和试剂：药品和试剂：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、NaCl、1M NaOH溶液。溶液
3、。2.器材：器材：试管、烧杯、量筒、玻璃棒、铁架台、漏斗、天平、试管、烧杯、量筒、玻璃棒、铁架台、漏斗、天平、牛角匙、高压锅、微波炉、牛角匙、高压锅、微波炉、pH试纸（试纸（5.5-9.0）、）、棉花、纱布、线绳、聚丙烯袋等。棉花、纱布、线绳、聚丙烯袋等。第4页，本讲稿共18页（四）步骤：（四）步骤：以固体斜面培养基制作为例以固体斜面培养基制作为例：计算计算 称量称量 加热融化加热融化 调调pH 过滤（可省略）过滤（可省略）分装分装 加塞（附棉塞加塞（附棉塞制作）制作）包扎包扎 灭菌灭菌 摆斜面摆斜面 无无菌检查菌检查第5页，本讲稿共18页 1.1.称量称量 按照培养基配方，准确称量各成份放按
4、照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。对于不是粉状药品（如牛肉膏）于烧杯中。对于不是粉状药品（如牛肉膏），应用烧杯和玻璃棒称量。，应用烧杯和玻璃棒称量。第6页，本讲稿共18页2.2.配制配制 向烧杯中加入适量的水，搅拌，使其溶向烧杯中加入适量的水，搅拌，使其溶解（可加热助溶）。解（可加热助溶）。如果配制固体培养基，在琼脂熔化时，如果配制固体培养基，在琼脂熔化时，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。一般要求琼脂沸腾出或烧焦。一般要求琼脂沸腾3 3次，完全熔次，完全熔化后，补足所失水分。化后，补足所失水分。第7页，本讲稿共18页 3.3.调节调节pH
5、pH值值 培养基溶解均匀后用培养基溶解均匀后用pHpH试纸测试纸测pHpH，然后根据要，然后根据要求加酸或碱（一般用求加酸或碱（一般用1M HCl1M HCl和和1M NaOH1M NaOH），要缓慢少），要缓慢少量且多加搅拌。培养基配方为自然量且多加搅拌。培养基配方为自然pHpH时，不用调节。时，不用调节。4.4.过滤过滤 用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。省去。第8页，本讲稿共18页 5.5.分装分装 将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。固体培养基要趁热装。（瓶）口塞上棉塞。固体培
6、养基要趁热装。分装时要避免培养基粘染管（瓶）口，引起污染。分分装时要避免培养基粘染管（瓶）口，引起污染。分装量如下：装量如下：（1 1）固体斜面培养基：装量为管长的）固体斜面培养基：装量为管长的1/51/5。（2 2）液体培养基：装量为管长的）液体培养基：装量为管长的1/41/4。（3 3）半固体培养基：装载量为管长的）半固体培养基：装载量为管长的1/31/3。第9页，本讲稿共18页6.6.灭菌灭菌 塞棉塞，包扎，灭菌。培养基做完后，要求在塞棉塞，包扎，灭菌。培养基做完后，要求在2-2-4 4小时内灭菌，否则会被污染。小时内灭菌，否则会被污染。7.7.摆斜面摆斜面 灭菌完毕，冷却到灭菌完毕，冷
7、却到6060左右再摆斜面，以免产生左右再摆斜面，以免产生过多冷凝水。过多冷凝水。第10页，本讲稿共18页（五）注意事项：（五）注意事项：1.1.称量要准确，取药品的角匙不能混用。称量要准确，取药品的角匙不能混用。2.2.加热融化时要不断搅拌，以免糊底和溢出。（每加热融化时要不断搅拌，以免糊底和溢出。（每加热加热30s30s看一次）看一次）3.3.蛋白胨极易吸湿，称取时动作要迅速。蛋白胨极易吸湿，称取时动作要迅速。4.4.培养基中如有微量成分，先配成浓缩溶液后再培养基中如有微量成分，先配成浓缩溶液后再加入。加入。5.5.节约药品。节约药品。第11页，本讲稿共18页牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培
8、养基(g/L)牛肉膏牛肉膏 3g蛋白胨蛋白胨 10gNaCl 5g琼脂琼脂 固体培养基为固体培养基为18g；半固体为半固体为10g；液体不加。；液体不加。水水 1000mlpH 7.0-7.2121灭菌灭菌20min第12页，本讲稿共18页棉塞制作棉塞制作第13页，本讲稿共18页二、消毒灭菌：二、消毒灭菌：物理法：加热、过滤、照射物理法：加热、过滤、照射化学法：化学药品化学法：化学药品灼烧灼烧干热干热湿热湿热加热加热高压高压间歇间歇煮沸煮沸第14页，本讲稿共18页 原理：原理：加热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质加热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质变性达到灭菌的目的。变性达到灭菌的目的
9、。干热：干热：160-170C 1.5-2h湿热：湿热：121.3C 15-30min紫外线灭菌是诱导胸腺嘧啶二聚体的形成，而紫外线灭菌是诱导胸腺嘧啶二聚体的形成，而抑制了抑制了DNA的复制。另外，电离过程中生成的的复制。另外，电离过程中生成的O3和和H2O2均有杀菌作用。均有杀菌作用。适用范围适用范围湿热主要用于各类培养基及液体物质湿热主要用于各类培养基及液体物质干热主要用于玻璃、金属等器皿、工具干热主要用于玻璃、金属等器皿、工具紫外线主要用于接种箱、无菌室内空气及物体紫外线主要用于接种箱、无菌室内空气及物体表面灭菌表面灭菌第15页，本讲稿共18页 操作步骤：操作步骤：1.湿热灭菌（高压蒸汽
10、）湿热灭菌（高压蒸汽）向锅内加入适量的水向锅内加入适量的水 装待灭菌物品装待灭菌物品 加盖加盖 加热加热 排冷空气排冷空气 升压、升温升压、升温 维持所需维持所需温度温度20-30min 降压、降温降压、降温 开盖取物开盖取物 趁热摆斜面趁热摆斜面 第16页，本讲稿共18页2.干热灭菌（干燥箱）干热灭菌（干燥箱）将待灭菌物品包好将待灭菌物品包好 装入待灭菌物品装入待灭菌物品 升温升温 恒温恒温 降温（降温（70以下）以下）开箱取物开箱取物 3.紫外线灭菌（接种箱或无菌室内）紫外线灭菌（接种箱或无菌室内）放入待灭菌物品放入待灭菌物品 甲醛（酒精）熏蒸甲醛（酒精）熏蒸 开紫外线灯（开紫外线灯（30
11、min）关灯关灯 工作工作第17页，本讲稿共18页 注意事项：注意事项：1.高压灭菌：切勿脱水工作，排净冷空气，工作高压灭菌：切勿脱水工作，排净冷空气，工作人员不能远离，当压力降到人员不能远离，当压力降到“0”时再开盖取物。时再开盖取物。2.干热灭菌：物品不要与烘箱内壁铁板接触；温干热灭菌：物品不要与烘箱内壁铁板接触；温度不能超过度不能超过170；待温度降至；待温度降至70以下后，再以下后，再开盖取物。开盖取物。3.紫外线灭菌：待灭菌物品要单摆开，不要直视紫外线灭菌：待灭菌物品要单摆开，不要直视紫外线光，更不能在紫外线光下工作。灭菌后紫外线光，更不能在紫外线光下工作。灭菌后通风，排出通风，排出O3。第18页，本讲稿共18页