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1、植物生理学实验七第1页，本讲稿共11页实验七实验七 植物体内游离脯氨酸含量的测定植物体内游离脯氨酸含量的测定 第2页，本讲稿共11页实验类型：基础验证型实验类型：基础验证型实验学时：实验学时：3学时学时一一 实验目的实验目的1.了解植物体内游离脯氨酸含量的变化，在一定程度上可以判了解植物体内游离脯氨酸含量的变化，在一定程度上可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力，也可作为断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力，也可作为植物抗旱育种、抗寒育种的一项生化指标。植物抗旱育种、抗寒育种的一项生化指标。2.学习测定脯氨酸含量的基本原理和方法。学习测定脯氨酸含量的基本原理和方法。第3页，本讲
2、稿共11页二二 实验原理实验原理在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量可增加酸含量可增加10100倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。因此，测定植物体内游离脯氨酸的含量，在一物的抗逆性有关。因此，测定植物体内游离脯氨酸的含量，在一定程度上可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力。定程度上可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力。采用磺
3、基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。（干或鲜样）限制。第4页，本讲稿共11页在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，此缩合物在物，此缩合物在520nm处有最大吸收峰，可以用分光光度法测处有最大吸收峰，可以用分光光度法测定。定。第5页，本讲稿共11页三三 主要仪器、试剂、实验材料主要仪器、试剂、实验材料仪器设备：分光光度计，水浴锅，试管，仪器设备：分光光度计，水浴
4、锅，试管，试剂试剂:1 2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和酸性茚三酮显色液：冰乙酸和 6M磷酸以磷酸以3:2混合，混合，作为溶剂进行配置，搅拌加热（低于作为溶剂进行配置，搅拌加热（低于70）溶解，冷却后置）溶解，冷却后置 棕色瓶中，棕色瓶中，4保存可使用保存可使用23d。2 甲苯，甲苯，3%磺基水杨酸溶液。磺基水杨酸溶液。3 脯氨酸标准溶液：称取脯氨酸标准溶液：称取25mg脯氨酸，用少量脯氨酸，用少量80%乙醇溶乙醇溶 解，蒸馏水定容至解，蒸馏水定容至250mL（100g/mL）。再取）。再取10ml用用 蒸馏水释定容至蒸馏水释定容至100ml（10g/mL）。材料：植物叶片。材料：植物叶片。
5、第6页，本讲稿共11页四四 实验步骤实验步骤1脯氨酸标准曲线制作：按下表操作脯氨酸标准曲线制作：按下表操作管号管号0123456标准脯氨酸标准脯氨酸/ml00.20.40.81.21.62.0H2O/ml2.01.81.61.20.80.40冰乙酸冰乙酸/ml22222223%磺基水杨酸磺基水杨酸/ml2222222显色液显色液/ml4444444脯氨酸含量脯氨酸含量/g0248121620混匀后在沸水浴加热混匀后在沸水浴加热60min，冷却，向各管加入，冷却，向各管加入4ml甲苯，充甲苯，充分震荡分震荡30S，静止片刻，以萃取红色物质，待分层后吸收甲苯层，静止片刻，以萃取红色物质，待分层后吸
6、收甲苯层以以0号管为对照在号管为对照在520nm下比色，作标准曲线。下比色，作标准曲线。第7页，本讲稿共11页2样品的测定样品的测定（1）脯氨酸的提取：称取待测叶片）脯氨酸的提取：称取待测叶片0.5g，加，加5ml3%磺基水杨酸磺基水杨酸研磨，匀浆移至离心管中，在沸水浴中提取研磨，匀浆移至离心管中，在沸水浴中提取10min，（提取过，（提取过程中要经常摇动），冷却后程中要经常摇动），冷却后3000r/min离心离心10min。（2）吸取）吸取0.2ml提取液于另一干净的试管中加提取液于另一干净的试管中加1.8ml，加，加2ml冰冰醋酸及醋酸及4ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热酸性茚三酮试剂，
7、在沸水浴中加热60min，溶液即，溶液即呈红色。冷却，向各管加入呈红色。冷却，向各管加入4ml甲苯，充分震荡，以萃取红色物甲苯，充分震荡，以萃取红色物质，静止待分层后吸收甲苯层以质，静止待分层后吸收甲苯层以0号管为对照在号管为对照在520nm下比下比色，得吸光度值。色，得吸光度值。第8页，本讲稿共11页五五结果计算结果计算式中：式中：C：由标准曲线上查得的脯氨酸的质量，：由标准曲线上查得的脯氨酸的质量，g V：提取液总体积，提取液总体积，mL a：测定液体积，测定液体积，mL W：样品质量，：样品质量，g第9页，本讲稿共11页注意事项注意事项配置的酸性茚三酮溶液仅在配置的酸性茚三酮溶液仅在24
8、h内稳定内稳定,最好现用现配最好现用现配.茚三酮茚三酮的用量与脯氨酸的含量相关的用量与脯氨酸的含量相关.一般当脯氨酸含量在一般当脯氨酸含量在10ug/ml以下时以下时,显色液中茚三酮的浓度要达到显色液中茚三酮的浓度要达到10mg/ml,才能保证脯氨酸充分显才能保证脯氨酸充分显色色.测定样品若进行过渗透胁迫处理测定样品若进行过渗透胁迫处理,结果会更显著结果会更显著.此法也可用于干样品中脯氨酸含量的测定此法也可用于干样品中脯氨酸含量的测定.第10页，本讲稿共11页六、思考题六、思考题1植物组织内游离脯氨酸测定有何意义？植物组织内游离脯氨酸测定有何意义？2脯氨酸提取除本实验方法外，还有何方脯氨酸提取除本实验方法外，还有何方 法？测定时应作哪些改变？法？测定时应作哪些改变？第11页，本讲稿共11页