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1、分光光度计基本原理与结构1 1第1页，本讲稿共45页 许多化学物质具有颜色，有些无颜色的化合物也可以与显色剂作用，生成有色物质。实践证明，有色溶液的浓度越大，颜色越深；浓度越小，颜色越浅。因此，可以通过比较溶液颜色深浅的方法来确定有色溶液的浓度，对溶液中所含的物质进行定量分析。基于比较颜色深浅对溶液进行定量分析的方法称为比色分析法。2 2第2页，本讲稿共45页溶液为什么会有颜色，颜色又为什么与浓度有关呢？下面就讨论这个问题。一、光的互补及有色物质的显色原理 1光的波粒二象性光是能的一种表现形式，是电磁波的一种。光在真空中以直线方式传播，在不同的介质处发生反射、折射、衍射、色散、干涉和偏振等现象
2、。可用波长、频率、传播速度等参量来描述，即光具有“波动性”。光的颜色即由光的波长决定，人眼能感觉到的光称为可见光，其波长在400750nrn之间。在可见光之外是红外光和紫外光。3 3第3页，本讲稿共45页同时，光也具有“粒子性”，光电效应就是一个很好的例子。光的粒子性理论认为，光是由“光子”（或称“光量子”）所组成。在辐射能量时，光是以一份一份的能量E的形式辐射的，同时光被吸收时，能量也是一份一份被吸收的。这每一份能量的大小为h。光子的能量与波长的关系为 E=h=hc 式中E为光子的能量（J：焦耳），为频率，h为普朗克常数（6.6310-34JS），c为光速，为光的波长 4 4第4页，本讲稿共
3、45页因此，不同波长的光，其能量不同，短波能量大，长波能量小。2。光的显色原理 若把某两种颜色的光，按一定的强度比例混合，能够得到白色光，则这两种颜色的光叫做互补色。图41中处于直线关系的两种光为互补色。如绿光和紫光为互补色，黄光和蓝光为互补色等等。各种溶液会呈现出不同的颜色，其原因是溶液中有色质点（分子或离子）选择性地吸收某种颜色的光。实验证明：溶液所呈现的颜色是其主要吸收光的互补色。如一束白光通过高锰酸钾溶液时，绿光大部分被选择吸收，其它的光透过溶液。从互补色示意图可以看出，透过光中只剩下紫色光，所以高锰酸钾溶液呈紫色。5 5第5页，本讲稿共45页6 6第6页，本讲稿共45页二、朗伯-比尔
4、（Lambert-Beer）定律溶液颜色的深浅与浓度之间的关系可以用吸收定律来描述。它是由朗伯定律和比尔定律相结合而成的，所以叫朗伯-比尔定律。原子吸收分光光度计也符合这个定律。溶液对光的吸收 当一束强度为I的平行单色光照到溶液时，一部分光被溶液吸收，一部分光被界面散射，其余的光则透过溶液，如图4-2所示7 7第7页，本讲稿共45页8 8第8页，本讲稿共45页有：I0=I a+I r+I tI0-入射光强度 I a-吸收光强度 I r-反射光强度 I t-透射光强度 通常由于I r很小可忽略不计，上式可简化为 I0=I a+I t透射光I t与入射光强度I0之比为透光率或透光度，用T表示：T=
5、I t/I a透光率的负对数称为吸光度或光密度或消光度，用A表示：A=lgT=lg1/T=lgI a/I t9 9第9页，本讲稿共45页吸光度越大，表示该物质对光的吸收越强。透光度和吸光度都是用来表示入射光被吸收的程度，它们之间可据式相互换算。实验证明，单色光经过有色溶液时，透过溶液的光强度不仅与溶液的浓度有关，而且还与溶液的厚度以及溶液本身对光的吸收性能有关。其规律可用下式表示为 AKCL 式中：A（E）吸光度（或叫做光密度，也可用D表示）；K某溶液的消光（吸收）系数；C溶液的浓度；L光程，即溶液的厚度。1010第10页，本讲稿共45页 消光系数K是一个常数。一种有色溶液对于一定波长（单色光
6、）的入射光的K值具有一定的数值。若溶液的浓度以摩尔升表示，溶液厚度以厘米表示，则此时的K值称为摩尔消光系数。摩尔消光系数是有色化合物的重要特性之一，根据这个数值的大小，可以估计显色反应的灵敏程度。从上式可以看出，当K和L不变时，光密度E与溶液浓度C成正比关系，也可以说，当一束单色入射光经过有色溶液且入射光、消光系数和溶液厚度不变时，吸光度A是随着溶液浓度而变化的。1111第11页，本讲稿共45页这种单色光与有色溶液的关系称为朗伯-比尔定律。光电比色计和分光光度计的比色分析方法就是根据这一定律来进行的。但是，朗伯-比尔定律只适用于单色光和低浓度的有色溶液。三、朗伯-比尔定律的应用 1等吸光度法
7、从朗伯-比耳定律可知，当用同一光源照射同一物质的不同浓度溶液时，若吸光度相等，则两溶液各自的浓度和透光液层厚度的乘积也相等。利用此关系在可见光区用眼作检测器（目视比色法），即可求出待测溶液的浓度。1212第12页，本讲稿共45页 2计算法 根据被测溶液浓度的大致范围，先配制一已知浓度的标准溶液。用同样的方法处理标准溶液与被测溶液，使其成色后，在同样的实验条件下用同一台仪器分别测定它们的吸光度。在标准溶液中：As=KsCsLs 在待测溶液中：Ax=KxCxLx 如果测定时选用相同厚度的比色皿使L相等，并使用同一波长的单色光，保持温度相同，则K也相等。将两式相除可得 As/Ax=Cs/Cx1313
8、第13页，本讲稿共45页 由此可见，在满足上述条件下，吸光度与溶液成正比。如果设计一种仪器，可以测量吸光度A值，则待测溶液的浓度即可求出 Cx=Ax/As Cs 由于仪器的性能和实验环境在不断的变化，所以在采用计算法时，必须每次都要对标准液和被测液进行测量，然后利用上式进行计算，否则会带来较大的测量误差。由于一般光电比色计在结构上有不少偏离朗伯一比耳定律的地方，故欲得到较准确的结果，常采用标准曲线法。1414第14页，本讲稿共45页3标准曲线法 这种方法分以下几步：（1）先配制五种以上标准浓度的溶液。（2）测出每种溶液的吸光度A。（3）做AC标准曲线图，如图43所示。有了标准工作曲线便可对溶液
9、进行测量。在同样的条件下，用仪器测出A后，查标准曲线即可得被测溶液的浓度值Cx。1515第15页，本讲稿共45页1616第16页，本讲稿共45页由于光电比色计工作在可见光区，只适合在有限个波长下测量，且波长的半宽度大。因此，它不能满足不同分析工作的需要。其次，光电比色计的灵敏度也低。为了克服以上不足，便发展了性能更好的分析方法：紫外-分光光度法。它利用单色器分光，其单色光纯度高，波长范围宽，并可连续变化，解决了光电比色计存在的问题。1717第17页，本讲稿共45页一、分光光度计基本原理和结构分子，包括双原子分子的光谱，要比原子光谱复杂得多。这是由于在分子中，除了电子相对于原子核的运动外，还有核
10、间相对位移引起的振动和转动。这三种运动能量都是量子化的，并对应有一定的能级。分子的总能量可以认为是这三种能量的总和，即 E=E。E振E转1818第18页，本讲稿共45页当用频率为的电磁波照射分子，而该分子的较高能级与较低能级之差E恰好等于该电磁波的能量 h时，即有E=h这里，h为普朗克常数。此时，在微观上出现分子由较低的能级跃迁到较高的能级，在宏观上则表现为透射光的强度变小。若用一连续辐射的电磁波照射分子，将照射前后光强度的变化转变为电信号，并记录下来，就可以得到一张光强度变化对波长的关系曲线图分子吸收光谱图。1919第19页，本讲稿共45页紫外-可见区的分子吸收光谱一般是谱带较宽的带状光谱，
11、它是由于电子能级跃迁而产生的光谱，因此又叫做电子光谱。分子吸收光谱与物质本身的结构有关，吸光度的大小与物质的含量有关，我们利用吸收光谱的形状和吸收程度的大小即可对物质进行定性和定量的分析。这种分析方法叫做分光光度法。二、分光光度计的基本结构与光电比色计相比，在结构上分光光度计用单色器代替了滤光片，其它部分两者比较相似。2020第20页，本讲稿共45页（）单色器：单色器是指一个光学系统，它比滤光片能更有效地提供带宽窄的单色光。单色器的主要组件是玻璃棱镜、复合滤光片或光栅。来自光源的光线，可直接通过单色器的狭缝，照到分光部件上。单色器的效率比普通滤光片高。在紫外和可见光范围内，半宽度不超过1nm。
12、1棱镜单色器从几何光学我们知道，当一束光从一种介质射到另一种介质时，在界面会发生折射和反射，如图4-3所示。设入射角为i，折射角为，则其折射率n为:n=Sini/sin2121第21页，本讲稿共45页不同的光学材料具有不同的折射率，这是众所周知的。即使使用同一种光学材料，以相同的人射角照射，若波长不同，得到的折射角也不一样。透明物质的折射率n和入射光波长的关系可以用下列经验式表示：n AB/2C/4式中A、B、C的数值与物质的性质有关。从式中可以看出，波长越长，折射率越小。一束复合光进入棱镜，由于不同波长的光，其折射率不同，通过棱镜后，复色光就按不同的波长分开来了，如图44所示。2222第22
13、页，本讲稿共45页2323第23页，本讲稿共45页 实验证明，棱镜的色散具有非线性，即谱线弯曲；不同波长区域色散效果不同，红端色散差，紫端色散较好。虽然在实际应用中的棱镜单色器与图示的不尽相同，然而它们的工作原理是一样的。2光栅单色器衍射光栅也可用作单色器。衍射光栅是由一系列刻划在高光洁度反射表面上沟纹组成的。沟纹排列异常密集，每英寸长度上有15000或30000条。将光栅放在一平行光束里，光栅的一面被照亮，这一面可看作是块非常小的反射镜。2424第24页，本讲稿共45页从沟纹反射镜反射出的光线相重叠，发生干涉，如图45所示。另一方面，如果在光线方向上的沟纹条数是波长的整数倍时，光线就被沟纹分
14、开，这种波就是同向的，射线被反射。当它不是波长的整数倍时，光线被抵消，没有反射现象。改变光线照到光栅上的角度，就可以改变反射光的波长。射线波长与反射角的关系，如下式：m=2dsin 式中，d 是沟纹之间的距离，是光栅常数；m是干涉价数。当m=1时，为一阶谱；m=2时，为二阶谱。2525第25页，本讲稿共45页光栅的分辨能力取决于它的mN值，N是光栅上总沟纹数或总条数。条数多时，一阶谱的分辨力高。与棱镜相比，光栅的分辨能力更高些，并能用于所有谱段范围，光栅的色散呈线性。2626第26页，本讲稿共45页2727第27页，本讲稿共45页 光栅的表面镀有铝膜，质地松软，极易擦伤。所以在维护时严禁用任何
15、擦拭物擦拭，更不能用手去触摸，否则，会造成永久损坏。也不准用嘴去吹光栅上的灰尘。光栅万一脏了，可以用洗耳球吹去表面上的灰尘。如不奏效，可以在光栅上均匀地涂上一层粘胶棉（俗称火棉胶）液，等胶液干了以后，将液膜轻轻揭下。此法可以将光栅上的脏物去掉。现在有的光栅已镀有保护膜。2828第28页，本讲稿共45页（二）准直镜和聚光镜：准直镜用来减小光束的尺寸并提供平行光，其多由凹面镜制成。凹面镜的反射镜面大都是镀铝的。在可见光区，铝膜外面常常再镀上一层SiO2保护层。但在紫外区，为了保证较高的反射效率。常常不镀此SiO2保护膜，这种准直镜的维护方法与光栅相同。聚光镜为一凸透镜。点光源发出的光，经聚光镜后，
16、变成平行光，然后再进入棱镜（或光栅）色散系统。色散后的平行光再经聚光镜会聚后，照射到比色皿上。2929第29页，本讲稿共45页 三、分光光度计的光学系统简介 分光光度计的光学系统有许多类型，不同类型的光学系统，对测量方法和结果都有一定影响，下面，我们介绍几种常用分光光度计的光学系统。（）单光束光学系统：它是分光光度计中最简单的和应用最普遍的一种。它的特点是只有一条光束。通过交换参比和样品的位置，使其分别进入光路。在参比（溶剂）进入光路时，调零。然后将样品进入光路的信号和参比信号进行比较，就可在显示器上读出样品的透过率和吸光度。结构如图46所示。3030第30页，本讲稿共45页3131第31页，
17、本讲稿共45页 单光束分光光度计由于在每个波长都需要变换参比和样品的位置，所以只能手动，不能扫描吸收光谱。它的结构比较简单，使用也有一定限制，但如配置程序控制和打印装置，则对一些常规的定量测定（如医院化验室）还是比较适用的。国产754型、WFDSA型、WFZ800D型分光光度计，以及国外的贝克曼DU型、岛津 QC50、QR50、日立 EPU2A型、希尔格 H700型、C4型等都属于这种类型的仪器。3232第32页，本讲稿共45页（二）双光束光学系统：单光束分光光度计虽简单价廉，但有如下缺陷：即它要求在整个测定过程中光源必须稳定不变；另外光电转换器和放大器如有不规则的特性会给测量结果带来误差。为
18、克服上述缺点，设计了双光束分光光度计。其结构示意图如图4-7所示。3333第33页，本讲稿共45页3434第34页，本讲稿共45页 双光束分光光度计的光路设计基本与单光束相似。差别在于双光束分光光度计的单色器的出射狭缝和样品室之间加了一个光束分裂器或斩波器，它的作用是以一定频率把一个光束交替分成两路。使一路经过参比溶液，另一路经过样品溶液，然后由一个检测器交替接收（或两个匹配检测器分别接收）参比信号和样品信号。接收的光信号转变成电信号后，由前置放大器放大，最后由显示系统显示透光度或吸光度。为了保持参考光路在不同的波长有恒定光电流输出，常采用两种设计方法：3535第35页，本讲稿共45页一种是采
19、用光电倍增管，电压恒定，但狭缝宽度随波长而变化；另一种是采用狭缝宽度恒定，但光电倍增管电压随波长而变化。后者便于在相同测定条件下对一些数据进行比较，双光束方式测定程序大大简化，不仅可直接读数、记录结果和数字显示，而且可进行“全波段自动扫描”，实现自动化分析，直接打印出分析结果，再加上附件的设置，更加扩展了它的使用范围。因此双光束分光光度计发展很快，使用更加普遍，比单光束分光光度计要优越得多。3636第36页，本讲稿共45页 双光束分光光度计种类很多，大致可分为中低档和高档两类。中低档的如上海第三分析仪器厂的710型（自动记录）、730型（数字显示）、740型。日本岛津公司的UV260，日立公司
20、的U1000/2000，Unicam公司的Pu-8600型，Varian公司的DMS系列，Perkinelmer公司的3、15、17型等。高档的一般都采用微机控制操作和处理数据，既可记录、打印，又有屏幕显示。且大多采用双单色器，使分辨率提高，杂散光减少此种类型的仪器如 PerkinElmer公司的Lambda9型，Beckman公司的DU60、70型，PyEUnicam公司的Pu8800型，岛津公司的UV265型，日立公司的U3200U3400型，Varian公司的22002300系列等。3737第37页，本讲稿共45页（三）双波长双光束分光光度计：由于单、双光束分光光度计都不能克服因非特征吸
21、收信号（如试液混浊引起的散射，比色皿-空气界面与比色皿-溶液界面的折射差别等）的影响而带来测量中的误差。为此提出了双波长测定法，用双波长分光光度计来测定高浓度试样的混浊试样以及多组分混合物的定量分析具有很大的优越性，提高了灵敏度和准确度。Chance实验室在1951年首先设计了世界上第一台双波长分光光度计。以后Aminco-Bow-man公司、日立公司和岛津公司等先后研制设计了各种类型的双波长分光光度计，如156型、365型、556型和557型；UV300型、UV-3000型等。3838第38页，本讲稿共45页3939第39页，本讲稿共45页从图48可知双波长分光光度计的基本原理是：从同一个光
22、源发出的光分成两束，分别经过两个单色器，得到两束具有不同波长（1和2）的单色光，利用切光器使这两束光以一定的时间间隔交替地照射到同一个试样池。经过光电倍增管和电子控制系统，在记录器上显示出两束光（1和2）的吸光度差A，即A=A1A。只要1和2选择得适当（被测物在一个波长上有最大吸收峰，在另一个波长上则不吸收或很少吸收；而非检测物对两种波长的吸收是相同的），A就为消除了非特征吸收影响（或称扣除了“背景吸收”）的吸光度。4040第40页，本讲稿共45页4141第41页，本讲稿共45页如图49所示，设在双波长测定中，入射到试样池的两束光强度相同，对应波长分别为1和2，其中AS为背景吸收，则有 A1
23、K1CL AS1 A2 K2CL AS2 若1和2选择适当，则可认为 AS1=AS2=AS，即背景吸收相同，这样透过试样池的两束光的吸光度差值为 A=A1A2=（K1K2）CL4242第42页，本讲稿共45页 A=A1A2=（K1K2）CL从上式可看出：A与被测组分的浓度C成正比。这就是双波长分光光度法定量分析的依据。下面以吸收点法测定二组分混合物中单个组分的含量为例，说明双波长分光测定的特点。如图4-9所示，图中A为干扰组分的吸收光谱；B为待测组分的吸收光谱；C为A和B的混合物的吸收光谱。选择A组分显示相等吸光度的两个波长1和2，则不管A组分浓度如何变化4343第43页，本讲稿共45页A=A
24、1A2=0 因此测定混合物C在1和2的吸光度差值，实际上就是B组分在1和2的吸光度差。由此可直接求得B组分的含量。这里必须指出：根据吸收曲线选择1和2时，应满足以下两个基本条件，即干扰组分在这两个波长应具有相同的吸光度，使干扰组分浓度的变化不影响测量值。其次，被测组分在这两个选定波长的吸光度差值应足够大，以便有足够的灵敏度。4444第44页，本讲稿共45页 从上述分析可看出，双波长分光光度计有很多优点。首先它不用参比溶液，只用一个待测溶液，完全扣除了背景噪声的干扰，也大大提高了测定的准确度，可用于微量成分的测定；其次可用于相互有干扰的多组分混合物中，不经分离可直接进行各组分的分析。对于生物材料、医药、食品等试样的分析具有特殊重要意义。4545第45页，本讲稿共45页