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1、实验八的限制性内切酶酶切和鉴定第1页，本讲稿共11页一、实验目的一、实验目的1.掌握限制性内切酶的特性。2.了解限制性内切酶的用途。第2页，本讲稿共11页二二、DNA限限 制制 性性 内内 切切 酶酶 概概 述述 和和 分分 析析 限限制制性性内内切切酶酶能能特特异异地地结结合合于于一一段段被被称称为为限限制制性性酶酶识识别别序序列列的的DNA序序列列之之内内或或其其附附近近的的特特异异位位点点上上,并并切切割割双双链链DNA。它它可可分分为为三三类类:类类和和类类酶酶在在同同一一蛋蛋白白质质分分子子中中兼兼有有切切割割和和修修饰饰(甲甲基基化化)作作用用且且依依赖赖于于ATP的的存存在在。类
2、类酶酶结结合合于于识识别别位位点点并并随随机机的的切切割割识识别别位位点点不不远远处处的的DNA，而而类类酶酶在在识识别别位位点点上上切切割割DNA分分子子,然然后后从从底底物物上上解解离离。类类由由两两种种酶酶组组成成:一一种种为为限限制制性性内内切切核核酸酸酶酶(限限制制酶酶),它它切切割割某某一一特特异异的的核核苷苷酸酸序序列列;另另一一种种为为独独立立的的甲甲基基化化酶酶,它它修修饰饰同同一一识识别别序序列列。类类中中的的限限制制性性内内切切酶酶在在分分子子克克隆隆中中得得到到了了广广泛泛应应用用，它它们们是重组是重组DNA的基础。的基础。绝大大多多数数类限限制制酶识别长度度为4至至8
3、个个核核苷苷酸酸的的回文回文对称特异核苷酸序列。称特异核苷酸序列。第3页，本讲稿共11页GAATTCCTTAAGEcoR AAGCTTTTCGAAHind 5555第4页，本讲稿共11页第5页，本讲稿共11页质粒质粒pUC18的物理图谱的物理图谱第6页，本讲稿共11页三、三、材料材料重组质粒；EcoRI酶及其酶切缓冲液:购买成品；Hind酶及其酶切缓冲液:购买成品;琼脂糖(Agarose)。四、四、仪器器移液器及吸头，水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机,恒温水浴锅,微量移液枪,微波炉或电炉,紫外透射仪。第7页，本讲稿共11页五、五、试剂 1、5TBE电泳缓冲液：配方见第一章。2、6电泳载样
4、缓冲液：0.25 溴粉蓝，40(w/v)蔗糖水溶液，贮存于 4。3、溴化乙锭(EB)溶液 第8页，本讲稿共11页六、操作步六、操作步骤 1、将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入质粒DNA（5-14 l）和相应的限制性内切酶反应10缓冲液2l,再加入重蒸水使总体积为18l,将管内溶液混匀后加入EcoRI和Hind各1l,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。2、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37水浴保温1-3小时,使酶切反应完全。3、每管加入2l 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。第9页，本讲稿共11页七、七、电泳泳检测 在1琼脂糖凝胶上进行电泳，EB染色，紫外 透射仪下观察或拍照。第10页，本讲稿共11页思考题：思考题：1.写出EcoRI和 Hind两种内切酶消化产物的末端序列。2.什么是粘性末端和平末端？3.限制性内切酶在基因工程中有什么作用？第11页，本讲稿共11页