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1、高等植物基因工程高等植物基因工程高等植物基因工程高等植物基因工程本讲稿第一页，共六十九页基因工程5 2 3 4 1 6 7 8 9 基因工程的基本概念基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程的基本原理基因工程所需的基本条件基因工程所需的基本条件基因工程的操作过程基因工程的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程酵母基因工程酵母基因工程哺乳动物基因工程哺乳动物基因工程高等植物基因工程高等植物基因工程本讲稿第二页，共六十九页A A 高等植物的遗传学特征高等植物的遗传学特征9 9 高等植物基因工程高等植物基因工程遗传操作的简易性遗传操作
2、的简易性整株植物的再生性整株植物的再生性染色体的多倍体性染色体的多倍体性植物的基本特征植物的基本特征本讲稿第三页，共六十九页植物的基本特征植物的基本特征植植 物物低低 等等 植植 物物藻类藻类 地衣地衣高高 等等 植植 物物无根、茎、叶等分化器官无根、茎、叶等分化器官合子不经胚直接发育为个体合子不经胚直接发育为个体含根、茎、叶、花、果分化器官含根、茎、叶、花、果分化器官合子经胚再发育为个体合子经胚再发育为个体苔藓门苔藓门 蕨类门蕨类门 裸子门裸子门 被子门被子门本讲稿第四页，共六十九页遗传操作的简易性遗传操作的简易性 大多数高等植物具有自我授精的遗传特征大多数高等植物具有自我授精的遗传特征，通
3、常能产生大量的后通常能产生大量的后代；而且借助于如风、重力、昆虫传播等自然条件，授精范围广、速度代；而且借助于如风、重力、昆虫传播等自然条件，授精范围广、速度快、效率高。因此，即便是频率极低的基因突变和重组事件，其遗传后快、效率高。因此，即便是频率极低的基因突变和重组事件，其遗传后果也易被观察。果也易被观察。本讲稿第五页，共六十九页整株植物的再生性整株植物的再生性 植物损伤后，会在伤口长出一块软组织，称为植物损伤后，会在伤口长出一块软组织，称为愈伤组织愈伤组织。如果将一小片鲜嫩的。如果将一小片鲜嫩的愈伤组织取下，放在含有合适营养和植物生长激素的组织培养基中，则这些细胞便会愈伤组织取下，放在含有
4、合适营养和植物生长激素的组织培养基中，则这些细胞便会持续生长并分裂成悬浮液。将这些细胞涂在特定的固体培养基上，就会长成新的幼芽，持续生长并分裂成悬浮液。将这些细胞涂在特定的固体培养基上，就会长成新的幼芽，并且这些愈伤组织重新分化成为叶、根、茎，最终成为整株开花植物。并且这些愈伤组织重新分化成为叶、根、茎，最终成为整株开花植物。愈伤组织的细胞分化取决于植物愈伤组织的细胞分化取决于植物生长素生长素（AuxinsAuxins）和）和分裂素分裂素（CytokininsCytokinins）的 相 对 浓 度）的 相 对 浓 度。生 长 素 与 分 裂 素 之 比 高，则 根 部 发 育；生 长 素生
5、长 素 与 分 裂 素 之 比 高，则 根 部 发 育；生 长 素与分裂素之比低，则茎部发育。与分裂素之比低，则茎部发育。本讲稿第六页，共六十九页整株植物的再生性整株植物的再生性 植物细胞通常不能有效地吸收外源植物细胞通常不能有效地吸收外源DNADNA，因为它们具有纤维素构成的细胞因为它们具有纤维素构成的细胞壁。可用纤维素酶处理植物细胞壁，形成壁。可用纤维素酶处理植物细胞壁，形成原生质体原生质体，待吸收，待吸收DNADNA分子后，经过分子后，经过再生再生，再通过，再通过愈伤组织愈伤组织形成培育出整株植物。这项技术有一定的局限性，即大多数形成培育出整株植物。这项技术有一定的局限性，即大多数单子叶
6、农作物单子叶农作物（如谷类作物）很难从原生质再生出完整细胞。（如谷类作物）很难从原生质再生出完整细胞。本讲稿第七页，共六十九页染色体的多倍体性染色体的多倍体性 很多高等植物拥有比人类更大的基因组，并以多倍体的形式存在。大约三很多高等植物拥有比人类更大的基因组，并以多倍体的形式存在。大约三分之二的分之二的禾本科植物禾本科植物呈多倍体型，其染色体数目范围从呈多倍体型，其染色体数目范围从2424至至144144不等。这种多倍体不等。这种多倍体植物在组织培养过程中呈现出较高的植物在组织培养过程中呈现出较高的遗传不稳定性遗传不稳定性，导致体细胞变异。，导致体细胞变异。本讲稿第八页，共六十九页B B 高等
7、植物基因工程的基本概念高等植物基因工程的基本概念9 9 高等植物基因工程高等植物基因工程高等植物基因工程高等植物基因工程高等植物细胞基因表达技术高等植物细胞基因表达技术高等植物转基因技术高等植物转基因技术转基因植株转基因植株植物工程细胞植物工程细胞农作物遗传性状改良农作物遗传性状改良蛋白多肽物质大规模生产蛋白多肽物质大规模生产小分子化合物大规模生产小分子化合物大规模生产本讲稿第九页，共六十九页高等植物基因工程的发展历程高等植物基因工程的发展历程1983 1983 年年 美国和比利时科学家首次将外源基因导入烟草和胡萝卜美国和比利时科学家首次将外源基因导入烟草和胡萝卜 1994 1994 年年 世
8、界上第一种耐储藏的番茄在美国批准上市世界上第一种耐储藏的番茄在美国批准上市 1995 1995 年年 转基因的抗虫、抗除草剂的玉米和棉花在美国投入生产转基因的抗虫、抗除草剂的玉米和棉花在美国投入生产2000 2000 年年 美国转基因大豆的种植面积首次超过普通大豆美国转基因大豆的种植面积首次超过普通大豆迄今为止迄今为止 世界上共批准了世界上共批准了1212种作物、种作物、6 6大类性状的大类性状的4848个转基因品种进行个转基因品种进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻
9、、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴桃、越橘、茄子、梨、苹果、葡萄等。桃、越橘、茄子、梨、苹果、葡萄等。本讲稿第十页，共六十九页C C 高等植物的基因转移系统高等植物的基因转移系统9 9 高等植物基因工程高等植物基因工程Ti Ti 质粒介导的整合转化程序质粒介导的整合转化程序植物病毒介导的转染程序植物病毒介导的转染程序植物细胞的直接转化程序植物细胞的直接转化程序植物原生质体的再生程序植物原生质体的再生程序本讲稿第十一页，共六十九页Ti Ti 质粒介导的
10、整合转化程序质粒介导的整合转化程序 几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤，这几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌农杆根瘤菌（A.tumefaciensA.tumefaciens）感 染 所 致，其 致 瘤 特 性 是 由 该 菌 细 胞 内 的 野 生感 染 所 致，其 致 瘤 特 性 是 由 该 菌 细 胞 内 的 野 生Ti Ti 质粒的结构与功能质粒的结构与功能型质粒型质粒 TiTi（Tumor-inducingTumor-inducing）介导的。介导的。本
11、讲稿第十二页，共六十九页Ti Ti 质粒的结构与功能质粒的结构与功能Ti Ti 质粒的图谱质粒的图谱整个质粒整个质粒 160-240 kb 160-240 kb其中其中 T-DNA 12-24 kb T-DNA 12-24 kbtms tms 的编码产物负责：的编码产物负责：合成吲哚乙酸合成吲哚乙酸tmr tmr 的编码产物负责：的编码产物负责：合成植物分裂素合成植物分裂素tmt tmt 的编码产物负责：的编码产物负责：合成氨基酸衍生物合成氨基酸衍生物冠瘿碱冠瘿碱本讲稿第十三页，共六十九页Ti Ti 质粒的结构与功能质粒的结构与功能Ti Ti 质粒致瘤的分子机制质粒致瘤的分子机制损伤的植物根部
12、会分泌出乙酰丁损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它们能香酸和羟基乙酰丁香酸，它们能诱导诱导TiTi质粒上的质粒上的virvir基因以及根瘤基因以及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达。菌染色体上的一个操纵子表达。virvir基因产物将基因产物将TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA单单链切下，而根瘤菌染色体上的操纵链切下，而根瘤菌染色体上的操纵子表达产物则与单链子表达产物则与单链T-DNAT-DNA结合结合形成复合物，后者转化植物根形成复合物，后者转化植物根部细胞。部细胞。本讲稿第十四页，共六十九页Ti Ti 质粒的结构与功能质粒的结构与功能T-DNAT-DNA的染色体整合机制
13、的染色体整合机制本讲稿第十五页，共六十九页T-DNAT-DNA的染色体整合机制的染色体整合机制Ti Ti 质粒的结构与功能质粒的结构与功能本讲稿第十六页，共六十九页Ti Ti 质粒的改造质粒的改造除除去去T-DNAT-DNA上上的的生生长长素素（tmstms）和和分分裂裂素素（tmrtmr）生生物物合合成成基基因因，因因为为大大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物；量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物；除除去去T-DNAT-DNA上上的的有有机机碱碱生生物物合合成成基基因因（tmttmt）；因因为为有有机机碱碱的的合合成成大大量量消消耗耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长；精氨
14、酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长；安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；安安装装植植物物细细胞胞的的筛筛选选标标记记，如如 neoneor r 基基因因，使使用用植植物物基基因因的的启启动动子子和和polyApolyA化信号序列；化信号序列；安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。除去除去 Ti Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度；质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度；本讲稿第十七页，共六十九页共整合转化程序共整合转化程序本讲稿第十八页，共六十九页
15、二元整合转化程序二元整合转化程序将将外外源源基基因因克克隆隆在在大大肠肠杆杆菌菌-农农杆杆菌菌穿穿梭梭质质粒粒的的T-DNAT-DNA区内；区内；重重组组质质粒粒直直接接转转化化农农杆杆菌菌株株，该该菌菌株株携携带带只只含含virvir区区不不含含T-DNAT-DNA区区的的TiTi辅助质粒；辅助质粒；以以上上述述重重组组农农杆杆菌菌感感染染植物细胞。植物细胞。本讲稿第十九页，共六十九页植物病毒介导的转染程序植物病毒介导的转染程序 随随着着植植物物病病毒毒分分子子生生物物学学及及遗遗传传学学研研究究的的不不断断深深入入，用用病病毒毒基基因因组组作作为为载载体体转转化化植植物物细细胞胞日日益益受
16、受到到人人们们的的重重视视，因因为为病病毒毒载载体体能能将将外外源源基基因因导导入入植植物物的的所有组织和细胞中，而且不受单子叶或双子叶的限制。所有组织和细胞中，而且不受单子叶或双子叶的限制。在在大大约约300300种种特特征征清清楚楚的的植植物物病病毒毒中中，单单链链RNARNA病病毒毒约约占占9191%，双双链链RNARNA病病毒毒、双双链链DNADNA病病毒毒、单单链链DNADNA病病毒毒各各占占3%3%。利利用用植植物物病病毒毒载载体体转转化化植植物物细细胞大致有以下两种战略：胞大致有以下两种战略：本讲稿第二十页，共六十九页植物病毒介导的转染程序植物病毒介导的转染程序 以以双双链链DN
17、ADNA病病毒毒花花椰椰菜菜花花斑斑病病毒毒（CaMVCaMV）基基因因组组作作为为载载体体，去去除除有有关关的的致致病病性性基基因因，换换上上外外源源基基因因，体体外外包包装装成成有有感感染染力力的的病病毒毒颗颗粒粒，转转染染植植物物细胞原生质体，并由此再生成整株植物。细胞原生质体，并由此再生成整株植物。转染植物细胞原生质体转染植物细胞原生质体本讲稿第二十一页，共六十九页植物病毒介导的转染程序植物病毒介导的转染程序 植植物物双双生生病病毒毒（GeminivirusesGeminiviruses）为为一一单单链链DNADNA病病毒毒，成成熟熟的的双双生生病病毒毒呈呈双双颗颗粒粒状状，每每一一个
18、个颗颗粒粒中中含含有有一一条条不不同同的的DNADNA单单链链。其其中中A A链链能能单单独独在在植植物物细细胞胞中中复复制制，并并含含有有一一部部分分病病毒毒包包衣衣蛋蛋白白基基因因；B B链链编编码码另另一一部部分分包包衣衣蛋蛋白白基基因因及及感感染染性性基基因因。A A、B B两两条条链链必必须须同同处处于于一一个个植植物物细细胞胞中中，方方能能形形成成有有感感染染力力的的病病毒毒。双生病毒具有广泛的宿主细胞范围，因此是一种很有潜力的植物病毒载体。双生病毒具有广泛的宿主细胞范围，因此是一种很有潜力的植物病毒载体。转染植物组织转染植物组织本讲稿第二十二页，共六十九页转染植物组织转染植物组织
19、双双 生生 病病 毒毒 家家 族族成成 员员 蕃蕃 茄茄 金金 花花叶叶病病毒毒（TGMVTGMV）克克隆隆表表达达载载体体的的构建程序构建程序 本讲稿第二十三页，共六十九页植物细胞的直接转化程序植物细胞的直接转化程序枪击法枪击法 将将待待转转化化的的DNADNA沉沉淀淀在在细细小小金金属属珠珠的的表表面面，用用特特制制枪枪将将金金属属珠珠直直接接打打入入植植物物细细胞胞，枪枪的的威威力力为为430 430 m m/s s，植植物物细细胞胞通通常常是是胚胚胎胎细细胞胞、玉玉米米籽籽、叶叶子等，但进去的子等，但进去的DNADNA片段整合效率极低。片段整合效率极低。本讲稿第二十四页，共六十九页电击
20、法电击法 将将高高浓浓度度的的质质粒粒DNADNA加加入入到到植植物物细细胞胞的的原原生生质质体体悬悬浮浮液液中中，混混合合物物在在 200 200-600 600 V V/cmcm 的的电电场场中中处处理理若若干干秒秒钟钟，然然后后将将原原生生质质体体在在组组织织培培养养基基中中生生长长 1 1-2-2 周，再生出整株植物。周，再生出整株植物。本讲稿第二十五页，共六十九页融合法融合法 将将外外源源DNADNA与与特特殊殊的的疏疏水水性性高高分分子子化化合合物物混混合合，在在水水中中这这些些疏疏水水性性化化合合物物分分子子形形成成球球状状的的脂脂质质体体，后后者者与与植植物物细细胞胞原原生生质
21、质体体融融合合，筛筛选选融融合合子子，再再生生植植物细胞壁。物细胞壁。所所有有涉涉及及到到植植物物原原生生质质体体的的基基因因转转化化方方法法均均存存在在一一个个难难题题，即即：原原生生质质体很难再生出整株植物。体很难再生出整株植物。本讲稿第二十六页，共六十九页花粉管导入法花粉管导入法 将将外外源源DNADNA沿沿着着花花粉粉管管经经过过珠珠心心进进入入尚尚未未形形成成正正常常细细胞胞壁壁的的卵卵、合合子子或或早早期期胚胚胎胎细细胞胞中中，从从而而实实现现基基因因的的转转移移。这这一一方方法法是是我我国国科科学学家家周周光光宇宇首首先先提提出出设设计计的的，目目前前已已应应用用于于水水稻稻、小
22、小麦麦、棉棉花花、大大豆豆、花花生生、蔬蔬菜菜等等作作物物的的转基因研究，转基因研究，花花粉粉管管导导入入法法的的特特点点是是直直接接、简简便便。它它的的受受体体材材料料为为植植株株整整体体，省省略略了了细细胞胞组组织织培培养养的的诱诱导导和和传传代代过过程程，排排除除了了植植株株再再生生的的障障碍碍，特特别别适适合合于于难难以以建建立立有有效效再再生生系系统统的的植植物物。由由于于转转化化的的是是完完整整植植株株的的卵卵细细胞胞、受受精精卵卵或或早早期期胚胚胎胎细细胞，导入的胞，导入的DNADNA分子整合效率较高。分子整合效率较高。本讲稿第二十七页，共六十九页植物原生质体的再生程序植物原生质
23、体的再生程序 原原生生质质体体的的再再生生效效率率在在植植物物转转基基因因技技术术中中至至关关重重要要。标标准准的的高高等等植植物物原原生生质质体体制制备备和和再再生生程程序序是是：将将植植物物嫩嫩叶叶、幼幼芽芽或或愈愈伤伤组组织织切切成成碎碎片片，浸浸入入含含有有纤纤维维素素酶酶的的缓缓冲冲液液中中保保温温；悬悬浮浮物物离离心心除除细细胞胞碎碎片片；将将原原生生体体悬悬浮浮液液滴滴在在无无菌菌滤滤纸纸片片上上，并并置置于于含含有有普普通通植植物物细细胞胞（即即所所谓谓的的滋滋养养细细胞胞）的的固固体体再再生生培培养养基基的的表表面面，使使原原生生质质体体与与滋滋养养细细胞胞不不直直接接接接触
24、触，但但可可吸吸收收由由滋滋养养细细胞胞分分泌泌扩扩散散出出来来的的植植物物生生长长因因子子及及其其它它化化合合物物；培培养养2-32-3周周后后，将将滤滤纸纸上上的的植植物物细细胞胞蔟蔟转转移移至至含含有有高高浓浓度度分分裂裂素素和和低低浓浓度度生生长长素素的的固固体体培培养养基基上上继继续续培培育育2-42-4周周，滤滤纸纸片片上上便便长长出出嫩嫩芽芽；将将嫩嫩芽芽置置入入含含有有低低浓浓度度生生长长素素而而无无分分裂裂素素的的固固体体培培养养基基上上，使使其其根根部部发发育育；大大约约3 3周周后后再再将将之之移移植植在在土土壤壤中，长成整株植物。中，长成整株植物。本讲稿第二十八页，共六
25、十九页植物原生质体的再生程序植物原生质体的再生程序本讲稿第二十九页，共六十九页D D 高等植物的基因表达系统高等植物的基因表达系统9 9 高等植物基因工程高等植物基因工程 植植物物转转基基因因技技术术已已成成为为研研究究和和改改良良植植物物遗遗传传资资源源的的强强有有力力工工具具，其其中中启启动动子子是是决决定定基基因因表表达达部部位位、时时间间、强强度度的的主主要要调调控控元元件件。花花椰椰菜菜花花斑斑病病毒毒CaMVCaMV的的35S35S启启动动子子能能在在许许多多植植物物物物种种中中的的几几乎乎所所有有发发育育阶阶段段及及所所有有组组织织中中高高效效表表达达，它已经被广泛用于构建转基因
26、植株。它已经被广泛用于构建转基因植株。在在高高等等植植物物基基因因工工程程中中，外外源源基基因因的的时时空空特特异异性性表表达达具具有有重重要要意意义义，因因为很多外源基因的表达产物对植物早期的生长和发育有影响，甚至会致死植株。为很多外源基因的表达产物对植物早期的生长和发育有影响，甚至会致死植株。本讲稿第三十页，共六十九页D D 高等植物的基因表达系统高等植物的基因表达系统9 9 高等植物基因工程高等植物基因工程外源基因的四环素诱导系统外源基因的四环素诱导系统外源基因的乙醇诱导系统外源基因的乙醇诱导系统外源基因的地塞米松诱导系统外源基因的地塞米松诱导系统外源基因的类固醇诱导系统外源基因的类固醇
27、诱导系统本讲稿第三十一页，共六十九页外源基因的四环素诱导系统外源基因的四环素诱导系统Tc-onTc-on型四环素诱导系统型四环素诱导系统CaMVCaMV 35S P 35S PPlantPlant nos t nos tTetRTetRE.coli tetRE.coli tetR四环素阻遏蛋白基因表达盒四环素阻遏蛋白基因表达盒CaMVCaMV 35S P 35S PPlantPlant nos t nos tbb-葡糖醛酸糖苷酶报告基因葡糖醛酸糖苷酶报告基因 GUS GUS四环素诱导型报告基因表达盒四环素诱导型报告基因表达盒tettet本讲稿第三十二页，共六十九页外源基因的四环素诱导系统外源基
28、因的四环素诱导系统Tc-onTc-on型四环素诱导系统型四环素诱导系统TetRTetRCaMVCaMV 35S P 35S PPlantPlant nos t nos tbb-葡糖醛酸糖苷酶报告基因葡糖醛酸糖苷酶报告基因 GUS GUStettetCaMVCaMV 35S P 35S PPlantPlant nos t nos tbb-葡糖醛酸糖苷酶报告基因葡糖醛酸糖苷酶报告基因 GUS GUStettet显色反应显色反应四环素四环素本讲稿第三十三页，共六十九页外源基因的四环素诱导系统外源基因的四环素诱导系统Tc-offTc-off型四环素阻遏系统型四环素阻遏系统CaMVCaMV 35S P
29、35S PPlantPlant nos t nos ttTAtTA融合蛋白融合蛋白tetRtetRtTAtTA激活因子表达盒激活因子表达盒CaMVCaMV 35S P 35S PPlantPlant nos t nos t荧光蛋白编码基因荧光蛋白编码基因 GFP GFP四环素阻遏型报告基因表达盒四环素阻遏型报告基因表达盒tettetVP16VP16本讲稿第三十四页，共六十九页外源基因的四环素诱导系统外源基因的四环素诱导系统Tc-offTc-off型四环素阻遏系统型四环素阻遏系统CaMVCaMV 35S P 35S PPlantPlant nos t nos t荧光蛋白编码基因荧光蛋白编码基因
30、GFP GFPtettetCaMVCaMV 35S P 35S PPlantPlant nos t nos t荧光蛋白编码基因荧光蛋白编码基因 GFP GFPtettet四环素四环素本讲稿第三十五页，共六十九页外源基因的乙醇诱导系统外源基因的乙醇诱导系统CaMVCaMV 35S P 35S PPlantPlant nos t nos tAlcRAlcR巢曲霉菌巢曲霉菌 alcR alcR转录激活因子表达盒转录激活因子表达盒CaMVCaMV 35S P 35S PPlantPlant nos t nos t氯霉素乙酰转移氯霉素乙酰转移酶基因酶基因 CAT CAT乙醇诱导型报告基因表达盒乙醇诱导型
31、报告基因表达盒alcA alcA 启动子控制区启动子控制区alcAalcA 巢曲霉菌乙醇降解酶编码基因巢曲霉菌乙醇降解酶编码基因 本讲稿第三十六页，共六十九页外源基因的乙醇诱导系统外源基因的乙醇诱导系统CaMVCaMV 35S P 35S PPlantPlant nos t nos tAlcRAlcR巢曲霉菌巢曲霉菌 alcR alcR转录激活因子表达盒转录激活因子表达盒CaMVCaMV 35S P 35S PPlantPlant nos t nos t氯霉素乙酰转移氯霉素乙酰转移酶基因酶基因 CAT CAT乙醇诱导型报告基因表达盒乙醇诱导型报告基因表达盒乙醇乙醇氯霉素抗性氯霉素抗性本讲稿第三
32、十七页，共六十九页外源基因的地塞米松诱导系统外源基因的地塞米松诱导系统CaMVCaMV 35S P 35S PPlantPlant nos t nos ttTAtTA融合蛋白融合蛋白Yeast Yeast Gal4Gal4tTAtTA激活因子表达盒激活因子表达盒PlantPlant P PPlantPlant nos t nos t荧光蛋白编码基因荧光蛋白编码基因 GFP GFP地塞米松诱导型报告基因表达盒地塞米松诱导型报告基因表达盒Gal4 Gal4 结合区结合区VP16VP16地塞米松诱导系统地塞米松诱导系统Rat Rat GRGR酵母转录因子酵母转录因子Gal4Gal4大鼠激素受体蛋白大
33、鼠激素受体蛋白单纯疱疹病毒转录激活因子单纯疱疹病毒转录激活因子本讲稿第三十八页，共六十九页外源基因的地塞米松诱导系统外源基因的地塞米松诱导系统CaMVCaMV 35S P 35S PPlantPlant nos t nos ttTAtTA融合蛋白融合蛋白Yeast Yeast Gal4Gal4VP16VP16地塞米松诱导系统地塞米松诱导系统Rat Rat GRGRPlantPlant P PPlantPlant nos t nos t荧光蛋白编码基因荧光蛋白编码基因 GFP GFPGal4 Gal4 结合区结合区地塞米松地塞米松本讲稿第三十九页，共六十九页外源基因的地塞米松诱导系统外源基因的地
34、塞米松诱导系统35S P35S PpAcos tpAcos tVP16VP16地塞米松诱导型四环素抑制型系统地塞米松诱导型四环素抑制型系统GRGRtetRtetRNLSNLSpA35S tpA35S tGUSGUS35S P35S Ptettet显色反应显色反应tetR tetR tet tet 结合蛋白结合蛋白NLSNLS 核定位信号序列核定位信号序列GR GR 激素受体蛋白激素受体蛋白VP16VP16 转录激活因子转录激活因子GUSGUS bb-葡糖醛酸糖苷酶报告基因葡糖醛酸糖苷酶报告基因 四环素四环素地塞米松地塞米松本讲稿第四十页，共六十九页外源基因的类固醇诱导系统外源基因的类固醇诱导系
35、统PPG10-90G10-90E9 tE9 thERhER雌激素诱导型的外源基因表达系统雌激素诱导型的外源基因表达系统lexAlexAVP16VP16nos tnos thpthptMCSMCSlexA lexA 细菌细菌 lexA lexA 基因的基因的 DNA DNA 结合区结合区VP16VP16 病毒转录激活因子编码区病毒转录激活因子编码区MCS MCS 外源基因多克隆位点外源基因多克隆位点hERhER 人雌激素受体编码区人雌激素受体编码区hpthpt 潮霉素抗性基因潮霉素抗性基因 雌激素雌激素PPNOSNOSlexA O-lexA O-35S P35S P3A t3A tXVEXVE转
36、录激活因子表达盒转录激活因子表达盒潮霉素标记基因表达盒潮霉素标记基因表达盒外源基因表达盒外源基因表达盒lexA O lexA O LexALexA蛋白结合位点蛋白结合位点本讲稿第四十一页，共六十九页外源基因的类固醇诱导系统外源基因的类固醇诱导系统蜕皮激素诱导型的外源基因表达系统蜕皮激素诱导型的外源基因表达系统35S P35S Pnos tnos tHEcR LBDHEcR LBDGR DBDGR DBDGRactGRactVP16VP16GUSGUS35S P35S Pnos tnos tGREGRE融合转录因子融合转录因子显色反应显色反应蜕皮激素蜕皮激素GRact GRact 激素受体转录激
37、活区激素受体转录激活区GR DBDGR DBD 激素受体激素受体DNADNA结合区结合区HEcR LBDHEcR LBD 昆 虫 激昆 虫 激素 受 体 的 配 体 结 合 区素 受 体 的 配 体 结 合 区本讲稿第四十二页，共六十九页E E 利用植物转基因技术研究基因的表达调控利用植物转基因技术研究基因的表达调控9 9 高等植物基因工程高等植物基因工程利用报告基因展示高等植物基因表达与调控的信息谱利用报告基因展示高等植物基因表达与调控的信息谱利用病毒载体探查植物基因重排利用病毒载体探查植物基因重排利用转座元件克隆植物基因利用转座元件克隆植物基因利用利用T-DNAT-DNA构建植物遗传突变株
38、构建植物遗传突变株本讲稿第四十三页，共六十九页利用报告基因展示高等植物基因表达与调控的信息谱利用报告基因展示高等植物基因表达与调控的信息谱TTPPbb-葡糖醛酸糖苷酶报告基因葡糖醛酸糖苷酶报告基因 GUS GUS应答调控元件应答调控元件转录调控因子转录调控因子卤代葡萄糖醛苷酸卤代葡萄糖醛苷酸 X-glucX-gluc蓝色化合物蓝色化合物荧光素酶报告基因荧光素酶报告基因 GFP GFP发射荧光发射荧光昆虫荧光素昆虫荧光素本讲稿第四十四页，共六十九页利用病毒载体探查植物基因重排利用病毒载体探查植物基因重排植物基因组植物基因组报告基因报告基因orioriApAprr病毒载体病毒载体本讲稿第四十五页，
39、共六十九页利用转座元件克隆植物基因利用转座元件克隆植物基因植物基因组植物基因组AcAc克隆克隆以以AcAc序列为探针杂交筛选序列为探针杂交筛选本讲稿第四十六页，共六十九页利用利用T-DNAT-DNA构建植物遗传突变株构建植物遗传突变株植物突变株基因组植物突变株基因组LBLB酶切酶切 连接连接 克隆克隆RBRBNTPIINTPIIpBR322pBR322卸下克隆的植物基因片段卸下克隆的植物基因片段重组克隆重组克隆DNADNA植物突变基因的植物突变基因的DNADNA片段片段杂交野生型植物基因组杂交野生型植物基因组基因序列分析基因序列分析经历突变的野生型全长基因经历突变的野生型全长基因本讲稿第四十七
40、页，共六十九页F F 利用转基因植物生产功能蛋白和工业原料利用转基因植物生产功能蛋白和工业原料9 9 高等植物基因工程高等植物基因工程利用植物生物反应器生产医用蛋白利用植物生物反应器生产医用蛋白利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂利用植物生物反应器生产工业原料利用植物生物反应器生产工业原料本讲稿第四十八页，共六十九页F F 利用转基因植物生产功能蛋白和工业原料利用转基因植物生产功能蛋白和工业原料9 9 高等植物基因工程高等植物基因工程转基因植物作为生物反应器的优势如下：转基因植物作为生物反应器的优势如下：植物易于生长，农田管理成本相对低廉，操作技术要求也
41、不高植物易于生长，农田管理成本相对低廉，操作技术要求也不高绝大多数植物的表达产物对人和牲畜无毒副作用，安全可靠绝大多数植物的表达产物对人和牲畜无毒副作用，安全可靠植物具有完整的真核表达修饰系统，利用转基因植物生产的重组蛋植物具有完整的真核表达修饰系统，利用转基因植物生产的重组蛋白药物和疫苗在分子结构和生物活性上，与人体来源的蛋白质相似白药物和疫苗在分子结构和生物活性上，与人体来源的蛋白质相似本讲稿第四十九页，共六十九页利用植物生物反应器生产医用蛋白利用植物生物反应器生产医用蛋白 借借助助于于根根瘤瘤农农杆杆菌菌介介导导的的转转化化系系统统，将将小小鼠鼠抗抗体体的的轻轻链链和和重重链链编编码码基
42、基因因分分别别置置于于两两种种烟烟草草植植物物体体内内表表达达，然然后后两两种种重重组组植植物物品品系系进进行行杂杂交交，产产生生的的子子代代植植物物能能同同时时合合成成小小鼠鼠的的轻轻链链和和重重链链两两种种多多肽肽。从从这这种种转转基基因因烟烟草草的的叶叶子子里里可可检检测测到到完完整整的的抗抗体体分分子子，含含量量为为叶叶细细胞胞蛋蛋白白总总量量的的1.5%1.5%。实实验验结结果果表表明明，植物细胞的蛋白分泌系统能够有效识别小鼠抗体前体的信号肽序列。植物细胞的蛋白分泌系统能够有效识别小鼠抗体前体的信号肽序列。转基因烟草表达小鼠抗体转基因烟草表达小鼠抗体本讲稿第五十页，共六十九页转基因烟
43、草表达小鼠抗体转基因烟草表达小鼠抗体本讲稿第五十一页，共六十九页利用植物生物反应器生产医用蛋白利用植物生物反应器生产医用蛋白 人人葡葡萄萄糖糖脑脑苷苷脂脂酶酶（hGChGC）是是治治疗疗高高歇歇斯斯症症（Gausher Gausher diseasedisease）遗遗传传病病的的特特效效药药，可可能能也也称称得得上上当当今今世世界界最最昂昂贵贵的的药药物物。每每生生产产一一个个剂剂量量的的hGChGC要要消消耗耗 2000-80002000-8000 只只人人类类胎胎盘盘，因因此此这这种种药药物物一一直直供供不不应应求求。美美国国VPIVPI研研究究机机构构的的专专家家将将克克隆隆的的hGC
44、hGC基基因因经经改改造造导导入入到到烟烟草草中中，并并获获得得高高效效表表达达。在在每每克克这这种种转转基基因因烟烟草草的的新新鲜鲜叶叶片片中中，hGChGC的的含含量量竟竟高高达达1mg1mg，也也就就是是说说，从从一一株株转转基基因烟草中就能产生出传统工艺需要消耗数千只胎盘才能获得的药物。因烟草中就能产生出传统工艺需要消耗数千只胎盘才能获得的药物。转基因烟草表达人转基因烟草表达人葡萄糖脑苷脂酶葡萄糖脑苷脂酶 本讲稿第五十二页，共六十九页利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂 果果聚聚糖糖是是果果糖糖的的多多聚聚体体，可可被被人人体体肠肠胃胃中中的的微
45、微生生物物发发酵酵，刺刺激激双双歧歧杆杆菌菌生生长长，释释放放短短链链脂脂肪肪酸酸进进入入循循环环系系统统，保保健健价价值值高高。3-63-6聚聚体体的的果果聚聚糖糖有有甜甜味味，是是低低能能量量的的助助甜甜剂剂，有有助助于于降降低低体体重重，因因此此国国际际上上果果聚聚糖糖的的销销售售量量很很大大。荷荷兰兰科科学学家家把把果果糖糖基基转转移移酶酶基基因因导导入入烟烟草草和和马马铃铃薯薯中中，在在获获得得的的转转基基因因植植株株中中，果聚糖含量占果聚糖含量占8%8%（干重）以上，具有良好的开发前景。（干重）以上，具有良好的开发前景。转基因烟草和马铃薯生产果聚糖转基因烟草和马铃薯生产果聚糖本讲稿
46、第五十三页，共六十九页利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂 在在许许多多植植物物的的种种子子中中，磷磷元元素素主主要要是是以以肌肌醇醇-6-6-磷磷酸酸（即即植植酸酸）的的形形式式存存在在。单单胃胃动动物物如如猪猪和和家家禽禽几几乎乎不不能能利利用用这这些些磷磷元元素素，因因此此必必须须在在饲饲料料中中添添加加无无机机磷磷以以满满足足动动物物营营养养的的需需要要。在在饲饲料料中中添添加加植植酸酸酶酶则则可可以以提提高高动动物物对对植植酸酸磷磷元元素素的的利利用用率率，减减少少动动物物粪粪便便中中磷磷酸酸盐盐含含量量，改改善善畜畜牧牧业业发发达达地地区区磷
47、磷酸酸盐盐富富集集化化污污染染的的程程度度。荷荷兰兰科科学学家家从从黑黑曲曲霉霉菌菌中中克克隆隆到到植植酸酸酶酶基基因因，并并将将之之导导入入到到烟烟草草的的种种子子中中表表达。在饲料中添加这种转基因烟草的种子便可达到良好的效果。达。在饲料中添加这种转基因烟草的种子便可达到良好的效果。转基因烟草生产植酸酶转基因烟草生产植酸酶本讲稿第五十四页，共六十九页利用植物生物反应器生产工业原料利用植物生物反应器生产工业原料 首首批批用用于于大大规规模模生生产产并并取取得得巨巨大大经经济济效效益益的的非非食食用用性性转转基基因因植植物物产产品品是是工工业业用用油油，其其中中包包括括制制造造肥肥皂皂等等去去垢
48、垢剂剂的的十十二二碳碳月月桂桂酸酸。油油菜菜通通常常产产生生十十八八碳碳的的不不饱饱和和脂脂肪肪酸酸，但但只只要要在在其其体体内内表表达达另另一一个个特特殊殊的的基基因因即即可可使使转转基基因因油油菜菜改改为为合合成成月月桂桂酸酸，并并可可使使其其含含量量提提高高到到44%44%。此此外外，鉴鉴于于油油菜菜植植物物易易生生长长且且产产量量高高的的特特点点，人人们们还还致致力力于于用用它它来来生生产产其其它它工工业业用用油油，如如可可作作润润滑滑油油和和尼尼龙龙生生产产原原料料的的芥芥酸酸以以及及用于麦淇淋制作的用于麦淇淋制作的6-6-十八碳烯酸十八碳烯酸等。等。转基因油菜生产肉桂酸转基因油菜生
49、产肉桂酸本讲稿第五十五页，共六十九页利用植物生物反应器生产工业原料利用植物生物反应器生产工业原料 聚聚-b b-羟羟基基烷烷酸酸（PHAsPHAs）和和聚聚羟羟基基丁丁酸酸（PHBPHB）两两种种结结构构相相似似的的多多聚聚体体具具有有热热塑塑性性好好、可可被被微微生生物物完完全全分分解解的的特特性性，因因此此被被认认为为是是最最好好的的无无污污染染性性塑塑料料原原料。料。转基因拟南芥生产聚羟基丁酸转基因拟南芥生产聚羟基丁酸 将将核核细细菌菌真真养养产产碱碱菌菌的的PHBPHB生生物物合合成成基基因因导导入入拟拟南南芥芥中中，转转基基因因植植物物在在整整个个生生命命周周期期中中，PHBPHB的
50、的含含量量逐逐步步增增加加，并并达达到到每每克克湿湿重重植植物物产产1010毫毫克克PHBPHB的的最最大大产产量，大约相当于细胞干重的量，大约相当于细胞干重的14%14%。本讲稿第五十六页，共六十九页G G 植物转基因技术在植物品种改良中的应用植物转基因技术在植物品种改良中的应用9 9 高等植物基因工程高等植物基因工程控制果实成熟的转基因植物控制果实成熟的转基因植物抗病虫害的转基因植物抗病虫害的转基因植物抗除草剂的转基因植物抗除草剂的转基因植物改变花卉形状和颜色的转基因植物改变花卉形状和颜色的转基因植物抗环境压力的转基因植物抗环境压力的转基因植物产高品质产物的转基因植物产高品质产物的转基因植