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1、会计学1DNA提取原理提取原理(yunl)和方法和方法91132第一页，共34页。DNA提取提取(tq)的几的几种方法种方法q基因组基因组DNADNA的提取的提取(tq)(tq)CTAB法SDS法其它(qt)第1页/共34页第二页，共34页。DNA提取提取(tq)的几种的几种方法方法q非基因组非基因组DNADNA的提取的提取(tq)(tq)质粒DNA的提取(tq)碱裂解法 煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法第2页/共34页第三页，共34页。基因组基因组DNA CTAB法法qCTAB法原理(yunl)（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethyl
2、ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。具有从低离子强度的溶液(rngy)中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液(rngy)里该复合物在高盐溶液(rngy)中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15 时会(sh hu)形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。第3页/共34页第四页，共34页。qCTAB提取(tq)缓冲液的经典配方 组份组份 Tr
3、is-HCl （pH8.0）EDTA（pH8.0）NaCl CTAB-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加）使用前加入入Tris-HCl（pH8.0）提供一个）提供一个(y)缓冲环境，防止核酸被破坏；缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一个提供一个(y)高盐环境，使高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白（脱氧核糖核蛋白）。）。CTAB溶解细胞膜，并结溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧
4、化成醌，避免褐变，使酚容易去除巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组基因组DNA CTAB法法第4页/共34页第五页，共34页。qCTAB提取缓冲液的改进(gijn)配方 组份组份 Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入使用前加入vPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少有效去除多酚，减少DN
5、A中酚的污染；同时它也能和多糖中酚的污染；同时它也能和多糖(du tn)结合，有结合，有效去除多糖效去除多糖(du tn)。基因组基因组DNA CTAB法法第5页/共34页第六页，共34页。PVP（聚乙烯吡咯烷酮）（聚乙烯吡咯烷酮）n nPVP PVP 按其平均分子量大小分为四级，习惯上常以按其平均分子量大小分为四级，习惯上常以按其平均分子量大小分为四级，习惯上常以按其平均分子量大小分为四级，习惯上常以K K值表示，不同的值表示，不同的值表示，不同的值表示，不同的K K值分别代表相应的值分别代表相应的值分别代表相应的值分别代表相应的PVPPVP平均分子量平均分子量平均分子量平均分子量范围范围范
6、围范围(fnwi)(fnwi)。K K值实际上是与值实际上是与值实际上是与值实际上是与PVPPVP水溶液的相对粘度水溶液的相对粘度水溶液的相对粘度水溶液的相对粘度有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的物有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的物有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的物有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的物理量，因此可以用理量，因此可以用理量，因此可以用理量，因此可以用K K值来表征值来表征值来表征值来表征PVPPVP的平均分子量。通的平均分子量。通的平均分子量。通的平均分子量。通常常常常K K值越大，其粘度越大，粘接性越强。值越大，其粘度越大，粘接性越强
7、。值越大，其粘度越大，粘接性越强。值越大，其粘度越大，粘接性越强。n n n n在研磨过程中加入在研磨过程中加入在研磨过程中加入在研磨过程中加入PVPPVP，其中的，其中的，其中的，其中的CO-N=CO-N=基有很强的结基有很强的结基有很强的结基有很强的结合多酚的能力，从源头上减少了酚类被氧化的机会。合多酚的能力，从源头上减少了酚类被氧化的机会。合多酚的能力，从源头上减少了酚类被氧化的机会。合多酚的能力，从源头上减少了酚类被氧化的机会。n n同时向抽提液中加入还原剂同时向抽提液中加入还原剂同时向抽提液中加入还原剂同时向抽提液中加入还原剂-巯基乙醇，后者能打断巯基乙醇，后者能打断巯基乙醇，后者能
8、打断巯基乙醇，后者能打断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随后经多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随后经多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随后经多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随后经抽提而去除。抽提而去除。抽提而去除。抽提而去除。第6页/共34页第七页，共34页。qCTAB法流程图植物(zhw)材料裂解(li ji)液上层(shngcng)溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组基因组DNA CTAB法法第7页/共34页第八页，共34页。q SDS SDS法原理法原理(yunl)(yunl)基因组基因组DNASDS法法SDS是一种阴离子去垢剂，
9、在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低(jingd)温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。组份组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH 8.0）NaCl SDS终浓度终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2%q SDS SDS法法DNADNA提取提取(tq)(tq)缓冲液缓冲液第8页/共34页第九页，共34页。2.65 水浴(shu y)60min,其间缓慢摇动几次。3.加入150ul 的5mol/LKac,混匀,冰浴15min
10、 左右第9页/共34页第十页，共34页。q SDS SDS法流程图法流程图 （以动物（以动物(dngw)(dngw)组织为例）组织为例）动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组基因组DNASDS法法第10页/共34页第十一页，共34页。基因组基因组DNA其它其它(qt)方法方法物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨(ynm)(ynm)法、法、法、法、冻融法冻融法冻融法冻融法化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法化学方式：异硫氰酸胍法、碱
11、裂解法化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式：酶法生物方式：酶法生物方式：酶法生物方式：酶法q根据细胞裂解方式(fngsh)的不同有：第11页/共34页第十二页，共34页。基因组基因组DNA其它其它(qt)方法方法吸附吸附(xf)材料材料结合法：结合法：q根据核酸(h sun)分离纯化方式的不同有：硅质材料阴离子交换树脂磁珠高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。第12页/共34页第十三页，共34页。基因组基因组DNA其它其它(qt)方法方法浓盐法浓盐法(yn
12、f)：有机溶剂抽提法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：密度梯度离心法：利用(lyng)RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物第13页/共34页第十四页，共34页。质粒质粒DNA碱裂解法碱裂解法q碱裂解法原理(yunl)染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理(chl)DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质
13、粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。第14页/共34页第十五页，共34页。质粒质粒DNA碱裂解法碱裂解法q碱裂解法流程图对数(du sh)期菌体溶液(rngy)III中和溶液(rngy)I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液第15页/共34页第十六页，共34页。SDSSDS碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒DNADNA中溶液中溶液中溶液中溶液1 1的成分的成分的成分的成分(chng fn)(chng fn)及作用及作用及作用及作用 n n溶液溶液溶液溶液 50mM 50mM 葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖/1
14、0mM EDTA/25mM Tris-HCl/10mM EDTA/25mM Tris-HCl，pH=8.0 pH=8.0 葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；子的底部；子的底部；子的底部；EDTA EDTA 抑制抑制抑制抑制DNaseDNase的活性。这一步溶液中还可以加的活性。这一步溶液中还可以加的活性。这一步溶液中还可以加的活性。这一步溶液中还可以加入入入入RNaseRNase，不受，不受，不受，不受EDTAEDTA影响，并且可以在后
15、续步骤中被除去影响，并且可以在后续步骤中被除去影响，并且可以在后续步骤中被除去影响，并且可以在后续步骤中被除去 n n溶液溶液溶液溶液 0.2M NaOH/1%SDS 0.2M NaOH/1%SDS 破细胞的主要是碱，而不是破细胞的主要是碱，而不是破细胞的主要是碱，而不是破细胞的主要是碱，而不是SDSSDS，所以才叫碱法抽提。，所以才叫碱法抽提。，所以才叫碱法抽提。，所以才叫碱法抽提。n n溶液溶液溶液溶液III 3M III 3M 醋酸钾醋酸钾醋酸钾醋酸钾/2M /2M 醋酸醋酸醋酸醋酸 n n这一步的这一步的这一步的这一步的K K置换了置换了置换了置换了SDSSDS（十二烷基磺酸钠）中的（
16、十二烷基磺酸钠）中的（十二烷基磺酸钠）中的（十二烷基磺酸钠）中的NaNa，得到，得到，得到，得到PDSPDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；（十二烷基磺酸钾）沉淀；（十二烷基磺酸钾）沉淀；（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDSSDS易与蛋白质结合易与蛋白质结合易与蛋白质结合易与蛋白质结合(jih)(jih)，平均两个氨基酸上结合，平均两个氨基酸上结合，平均两个氨基酸上结合，平均两个氨基酸上结合(jih)(jih)一个一个一个一个SDSSDS分子，钾钠离子置分子，钾钠离子置分子，钾钠离子置分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时
17、换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组基因组基因组基因组DNADNA也被也被也被也被PDSPDS共沉淀共沉淀共沉淀共沉淀 第16页/共34页第十七页，共34页。质粒质粒DNA煮沸法煮沸法q煮沸法原理(yunl)染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成(xngchng)沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液
18、相中，从而可通过离心将两者分开。第17页/共34页第十八页，共34页。细胞器细胞器DNA差速离心法差速离心法q差速离心法原理(yunl)是利用物质比重的不同分离(fnl)混合物的一种方法。将待分离(fnl)物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离(fnl)。线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小(dxio)一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。第18页/共34页第十九页，共34页。DNA提取的基本提取的基本(jbn)步骤步骤I.
19、材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸(h sun)分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸(h sun)，并去除杂质V.核酸(h sun)溶解在适量缓冲液或水中第19页/共34页第二十页，共34页。材料材料(cilio)准备准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解(jin ji)含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集基因组DNA的提取(tq)质粒DNA的提取使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如
20、为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）第20页/共34页第二十一页，共34页。严谨性质粒和松弛(sn ch)性质粒n n按照复制性质，可以(ky)把质粒分为两类：n n一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有12个质粒；n n另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。第21页/共34页第二十二页，共34页。细胞细胞(xbo)裂解裂解材料(ci
21、lio)应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料(cilio)，选择适当的裂解预处理方式：植物材料(cilio)液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡基因组DNA的提取(tq)质粒DNA的提取菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染G菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁第22页/共34页第二十三页，共34页。核酸核酸(h sun)分离、纯分离、纯化化采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相
22、应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定(ydng)的转速和时间（猕猴桃大提，10000转20min）针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法基因组DNA的提取(tq)质粒DNA的提取第23页/共34页第二十四页，共34页。核酸核酸(h sun)分离、分离、纯化纯化q蛋白质的去除(q ch)：q酚/氯仿抽提q使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）q高盐洗涤q蛋白酶处理第24页/共34页第二十五页，共34页。q多糖的去除：q高盐法：用乙醇(y chn)沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。q用多糖水解酶
23、将多糖降解。q在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。q用PEG8000代替乙醇(y chn)沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20%PEG8000(含1.2 M NaCl)，冰浴20min。核酸分离核酸分离(fnl)、纯化、纯化第25页/共34页第二十六页，共34页。q多酚的去除：q在抽提液中加入防止酚类氧化(ynghu)的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等q加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合核酸分离核酸分离(fnl)、纯化、纯化q盐离子(lz)的去
24、除：q70的乙醇洗涤第26页/共34页第二十七页，共34页。核酸沉淀核酸沉淀(chndin)、溶解溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分(chngfn)沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分(chngfn)沉淀沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分(chngfn)挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解 基因组DNA的提取(tq)质粒DNA的提取第27页/共34页第二十八页，共34页。1.1.DNADNA中含有蛋白、
25、中含有蛋白、多糖、多酚类杂多糖、多酚类杂质质2.2.DNADNA在溶解前，有在溶解前，有酒精酒精(jijng)(jijng)残残留，酒精留，酒精(jijng)(jijng)抑制后抑制后续酶解反应续酶解反应3.3.DNADNA中残留有金属中残留有金属离子离子1.1.重新纯化重新纯化DNADNA，去除蛋，去除蛋白、多糖、多酚等杂质白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）（具体方法见前）2.2.重新沉淀重新沉淀DNADNA，让酒精，让酒精充分挥发充分挥发3.3.增加增加7070乙醇洗涤乙醇洗涤(xd)(xd)的次数（的次数（2-32-3次）次）DNA提取提取(tq)常常见问题见问题q问题一：DNA样品不
26、纯，抑制后续酶解和PCR反应。原因对策第28页/共34页第二十九页，共34页。1.1.材料不新鲜或反复材料不新鲜或反复冻融冻融2.2.未很好抑制内源核未很好抑制内源核酸酶的活性酸酶的活性3.3.提取过程操作过于提取过程操作过于(guy)(guy)剧烈，剧烈，DNADNA被机械打断被机械打断4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反复冻融反复冻融1.1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融反复冻融2.2.液氮研磨或匀浆液氮研磨或匀浆(yn jin)(yn jin)组织后，组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液应在解冻前加入裂解缓冲液3.3.在提取内源核酸酶含量丰
27、富的材料的在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNADNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量时，可增加裂解液中螯合剂的含量4.4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高温所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌灭菌6.6.将将DNADNA分装保存于缓冲液中，避免反复分装保存于缓冲液中，避免反复冻融冻融DNA提取提取(tq)常见常见问题问题q问题二：DNA降解。对策 原因第29页/共34页第三十页，共34页。1.1.实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全(wnqun)(wnqun)4
28、.4.洗涤时洗涤时DNADNA丢失丢失1.1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2.2.动植物要匀浆研磨充分；动植物要匀浆研磨充分；G G菌、菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁式破壁3.3.高温裂解时，时间适当延长（对高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加于动物细胞、细菌可增加PKPK的用的用量）量）4.4.低温沉淀，延长沉淀时间低温沉淀，延长沉淀时间5.5.加辅助物，促进沉淀加辅助物，促进沉淀6.6.洗涤时，最好洗涤时，最好(zu ho)(zu ho)用枪头用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒将洗涤液吸出，勿倾倒DNA提取提取(tq)常见常
29、见问题问题q问题三：DNA提取量少。对策 原因第30页/共34页第三十一页，共34页。猕猴桃猕猴桃DNA提取提取(tq)实例实例n n1.CTAB1.CTAB配方如上配方如上,配制好备用配制好备用,65,65度水浴预热。猕猴桃叶片或度水浴预热。猕猴桃叶片或果实采取后最好立即放到液氮中果实采取后最好立即放到液氮中,避免酚类物质氧化避免酚类物质氧化 n n2.652.65水浴一个小时水浴一个小时 n n3.3.氯仿：乙醇：异戊醇氯仿：乙醇：异戊醇=80:16:4=80:16:4的抽提液的抽提液 两次。两次。1000010000转转/分分离心离心2020分钟，尽量把丝状物压紧，避免吸取上清时有丝状物分钟，尽量把丝状物压紧，避免吸取上清时有丝状物牵拉牵拉 n n等体积预冷的异丙醇等体积预冷的异丙醇 ，75%75%乙醇洗去其他杂质乙醇洗去其他杂质(zzh)(zzh)。洗两。洗两次次 。n n用无水乙醇用无水乙醇5 5毫升洗一次。晾干毫升洗一次。晾干5 5分钟挥发掉乙醇后加入分钟挥发掉乙醇后加入3-3-5mlTE5mlTE溶解，加入溶解，加入5ul,1mg/ml5ul,1mg/ml的的RNARNA酶后保存酶后保存 第31页/共34页第三十二页，共34页。猕猴桃基因组猕猴桃基因组DNA第32页/共34页第三十三页，共34页。第33页/共34页第三十四页，共34页。