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1、色谱分离法色谱分离法第一节第一节 概述概述色谱法简介色谱法简介色谱法简介色谱法简介 色谱法早在色谱法早在色谱法早在色谱法早在1903190319031903年由俄国植物学家年由俄国植物学家年由俄国植物学家年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。茨维特分离植物色素时采用。茨维特分离植物色素时采用。茨维特分离植物色素时采用。他在研究植物叶的色素成分时，将他在研究植物叶的色素成分时，将他在研究植物叶的色素成分时，将他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚
2、使其直立玻璃管内，然后加入石油醚使其直立玻璃管内，然后加入石油醚使其直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分自由流下，结果色素中各组分互相分自由流下，结果色素中各组分互相分自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方离形成各种不同颜色的谱带。这种方离形成各种不同颜色的谱带。这种方离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐法因此得名为色谱法。以后此法逐渐法因此得名为色谱法。以后此法逐渐法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，应用于无色物质的分离，应用于无色物质的分离，应用于无色物质的分离，“色谱色谱色谱色谱”二二二二
3、字虽已失去原来的含义，但仍被人们字虽已失去原来的含义，但仍被人们字虽已失去原来的含义，但仍被人们字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。沿用至今。沿用至今。沿用至今。在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为不动的一相（固体或液体）称为固定相固定相；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为为流动相流动相；装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱色谱柱 。第一节第一节 概述概述色谱分离（色谱分离（Chromatographic Resolut
4、ionChromatographic Resolution，CRCR）利用利用多组分混合物多组分混合物中中各组分物理化学性质（如吸附力、分子极性、分子形状和大小、分子各组分物理化学性质（如吸附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲合力、分配系数等）的差别，使各组分以不同程度分布在亲合力、分配系数等）的差别，使各组分以不同程度分布在固定相固定相和和流动相流动相中。当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理化学性中。当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理化学性质的差别，而以不同的速率移动，使之分离。质的差别，而以不同的速率移动，使之分离。分离效率高，每米柱长可达几千至几十万的塔板数；分离效率
5、高，每米柱长可达几千至几十万的塔板数；应用范围广，从极性到非极性、离子型到非离子型、小分子到大分子、应用范围广，从极性到非极性、离子型到非离子型、小分子到大分子、无机到有机及生物活性物质，以及热稳定到热不稳定的化合物，尤其无机到有机及生物活性物质，以及热稳定到热不稳定的化合物，尤其是对生物大分子样品的分离，是其他方法无法代替的；是对生物大分子样品的分离，是其他方法无法代替的；选择性强；选择性强；高灵敏度的在线检测，可采用不同的高灵敏度检测器进行连续的在线高灵敏度的在线检测，可采用不同的高灵敏度检测器进行连续的在线检测；检测；快速分离；快速分离；过程自动化操作。过程自动化操作。优点优点1.按分离
6、机理不同分类按分离机理不同分类第二节、色谱分离的分类第二节、色谱分离的分类n吸附色谱分离（吸附色谱分离（Adsorption ChromatographyAdsorption Chromatography，ACAC）n分配色谱（分配色谱（Distribution ChromatographyDistribution Chromatography，DCDC）n离子交换色谱（离子交换色谱（Ion Exchange ChromatographyIon Exchange Chromatography，IECIEC）n凝胶色谱（凝胶色谱（Gel ChromatographyGel Chromatogra
7、phy，GCGC）n亲合色谱（亲合色谱（Affinity ChromatographyAffinity Chromatography，AFCAFC）吸附色谱分离吸附色谱分离是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。新的吸附色谱技术有新的吸附色谱技术有：疏水作用色谱（疏水作用色谱（Hydrophobic Interaction ChromatographyHydrophobic Interaction Chromatography，HICHIC）、
8、）、金属螯合作用色谱（金属螯合作用色谱（Metal Metal ChelationChelation Chromatography Chromatography，MCCMCC）、）、共价作用色谱（共价作用色谱（Covalent Interaction ChromatographyCovalent Interaction Chromatography，CICCIC）等；）等；吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙、氧化钛、氢氧吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙、氧化钛、氢氧化锌凝胶等。化锌凝胶等。无机吸附剂在有机大分子色层分离中的实用例子无机吸附剂在有机大分子色层分离中的实用例子
9、丝裂霉素丝裂霉素的精制的精制。丝裂霉素的发酵滤液用活性炭吸附，丙酮洗脱，丝裂霉素的发酵滤液用活性炭吸附，丙酮洗脱，蒸去丙酮的浓缩水溶液，用氯仿萃取。蒸去丙酮的浓缩水溶液，用氯仿萃取。氯仿萃取液上氧化铝柱，先用氯仿冲洗，能部分分带，氯仿萃取液上氧化铝柱，先用氯仿冲洗，能部分分带，接着以氯仿丙酮（接着以氯仿丙酮（3:23:2）展开，约）展开，约2 2小时后，能分出色小时后，能分出色层，其中蓝层，其中蓝紫色色带为有效成分丝裂霉素紫色色带为有效成分丝裂霉素C C。将柱推出，切取蓝紫色部分，用将柱推出，切取蓝紫色部分，用1010甲醇氯仿洗脱，甲醇氯仿洗脱，减压蒸干，减压蒸干，在甲醇苯中结晶，即可得蓝紫色
10、丝裂霉在甲醇苯中结晶，即可得蓝紫色丝裂霉素素C C结晶。结晶。分配色谱分配色谱是利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同是利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。而分离。根据固定相和流动相的极性与非极性的差别，分配色谱可分根据固定相和流动相的极性与非极性的差别，分配色谱可分根据固定相和流动相的极性与非极性的差别，分配色谱可分根据固定相和流动相的极性与非极性的差别，分配色谱可分为正相色谱和反相色谱。为正相色谱和反相色谱。为正相色谱和反相色谱。为正相色谱和反相色谱。正相色谱正相色谱（Normal Phase ChromatographyNormal Phase Chromatograp
11、hy，NPCNPC）的固定相为极性，流）的固定相为极性，流动相为非极性，当混合物随流动相通过固定相时，极性较强的化合物被动相为非极性，当混合物随流动相通过固定相时，极性较强的化合物被保留，极性较弱的化合物先被洗脱下来。保留，极性较弱的化合物先被洗脱下来。反相色谱反相色谱（Reversed Phase ChromatographyReversed Phase Chromatography，RPCRPC），固定相为非极性，），固定相为非极性，流动相为极性，用于分离非极性或弱极性物质。流动相为极性，用于分离非极性或弱极性物质。离子交换色谱离子交换色谱是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动是基于离子交
12、换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，由于混合物中相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，由于混合物中不同溶质对交换剂具有不同的亲合力而将它们分离。不同溶质对交换剂具有不同的亲合力而将它们分离。该法适合于离子和在溶剂中可发生电离的物质的分离。该法适合于离子和在溶剂中可发生电离的物质的分离。大多数生物大分子都是极性的，都可使其电离，所以离子交大多数生物大分子都是极性的，都可使其电离，所以离子交大多数生物大分子都是极性的，都可使其电离，所以离子交大多数生物大分子都是极性的，都可使其电离，所以离子交换色谱广泛用于生物大分子的分离纯化，特别是在蛋白质、换色谱广泛用于生物大分
13、子的分离纯化，特别是在蛋白质、换色谱广泛用于生物大分子的分离纯化，特别是在蛋白质、换色谱广泛用于生物大分子的分离纯化，特别是在蛋白质、多肽、核酸等生物物质的分离纯化中，离子交换色谱分离占多肽、核酸等生物物质的分离纯化中，离子交换色谱分离占多肽、核酸等生物物质的分离纯化中，离子交换色谱分离占多肽、核酸等生物物质的分离纯化中，离子交换色谱分离占主导地位。主导地位。主导地位。主导地位。碱性水溶性抗生素的分离和分析也常用离子交换色层分离法。碱性水溶性抗生素的分离和分析也常用离子交换色层分离法。例例卡那霉素卡那霉素A,B,CA,B,C可以用强碱性树脂可以用强碱性树脂Dowex12Dowex12（OHOH
14、型），以水型），以水作展开剂，进行离子交换色层分离法分离。作展开剂，进行离子交换色层分离法分离。在在0.939cm0.939cm的色层分离柱中（树脂用量的色层分离柱中（树脂用量252550 mL50 mL，粒度，粒度200200400400目），流速控制在目），流速控制在202030 mL/h30 mL/h，卡那霉素，卡那霉素B B最先流最先流出，接着卡那霉素出，接着卡那霉素C C，最后卡那霉素，最后卡那霉素A A自柱中流出。自柱中流出。凝胶色谱凝胶色谱以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子大小不同以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子大小不同而进行分离的色谱技术，又称为分子筛色谱（而进行分离的色
15、谱技术，又称为分子筛色谱（Molecular Sieve Molecular Sieve ChromatographyChromatography，MSCMSC）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱（）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱（Size Size Exclusion ChromatographyExclusion Chromatography，SECSEC）。）。凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子。当混合物随流动凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子。当混合物随流动相流经凝胶柱时，较大的分子
16、不能进入所有的凝胶网孔而受相流经凝胶柱时，较大的分子不能进入所有的凝胶网孔而受到排阻，它们将与流动相一起首先流出，较小的分子能进入到排阻，它们将与流动相一起首先流出，较小的分子能进入部分凝胶网孔，流出的速度较慢，更小的分子能进入全部凝部分凝胶网孔，流出的速度较慢，更小的分子能进入全部凝胶网孔，而最后从凝胶柱中流出。胶网孔，而最后从凝胶柱中流出。凝胶色谱主要用于脱盐、分级分离及分子量的测定。凝胶色谱主要用于脱盐、分级分离及分子量的测定。应用举例应用举例（1）去热原去热原（2 2）纯化青霉素）纯化青霉素（3 3）大分子物质的分子量测定）大分子物质的分子量测定将离子交换树脂制备的无盐水通过羟型将离子
17、交换树脂制备的无盐水通过羟型DEAE-A-25DEAE-A-25凝胶，可制得无热原水，用于注射。凝胶，可制得无热原水，用于注射。用葡聚糖凝胶用葡聚糖凝胶G-25G-25（粒度为（粒度为20208080mm）分离青）分离青霉素中的一些高分子杂质（青霉素聚合物、青霉霉素中的一些高分子杂质（青霉素聚合物、青霉噻唑蛋白），去除这些强烈致敏性的全抗原。噻唑蛋白），去除这些强烈致敏性的全抗原。生物体中许多大分子化合物具有与其结构相对应的专生物体中许多大分子化合物具有与其结构相对应的专一分子可逆结合的特性，如酶蛋白与辅酶、抗原和抗一分子可逆结合的特性，如酶蛋白与辅酶、抗原和抗体、激素与其受体、核糖核酸与其互
18、补的脱氧核糖核体、激素与其受体、核糖核酸与其互补的脱氧核糖核酸等体系，把与目的产物具有特异亲合力的生物分子酸等体系，把与目的产物具有特异亲合力的生物分子固定化后作为固定相，当含有目的产物的混合物（流固定化后作为固定相，当含有目的产物的混合物（流动相）流经此固定相时，即可把目的产物从混合物中动相）流经此固定相时，即可把目的产物从混合物中分离出来。分离出来。亲合色谱亲合色谱对于生物大分子化合物的分离纯化具有特别重要的意义。对于生物大分子化合物的分离纯化具有特别重要的意义。酶酶酶酶底物或底物类底物或底物类底物或底物类底物或底物类似物似物似物似物外源凝集素外源凝集素外源凝集素外源凝集素多糖化合物多糖化
19、合物多糖化合物多糖化合物抑制剂抑制剂抑制剂抑制剂糖蛋白糖蛋白糖蛋白糖蛋白辅因子辅因子辅因子辅因子细胞表面受体细胞表面受体细胞表面受体细胞表面受体蛋白蛋白蛋白蛋白抗体抗体抗体抗体抗原抗原抗原抗原细胞细胞细胞细胞病毒病毒病毒病毒核酸核酸核酸核酸互补碱基链段互补碱基链段互补碱基链段互补碱基链段细胞细胞细胞细胞组蛋白组蛋白组蛋白组蛋白激素、微生物激素、微生物激素、微生物激素、微生物受体蛋白受体蛋白受体蛋白受体蛋白核酸聚合酶核酸聚合酶核酸聚合酶核酸聚合酶载体蛋白载体蛋白载体蛋白载体蛋白核酸结合蛋白核酸结合蛋白核酸结合蛋白核酸结合蛋白生物亲和关系生物亲和关系u柱色谱柱色谱，具有进样量大，回收容易等优点，但
20、其分辨率不如具有进样量大，回收容易等优点，但其分辨率不如纸上色谱和薄层色谱高；纸上色谱和薄层色谱高；u纸上色谱纸上色谱，以滤纸为载体，是以滤纸纤维及其结合水作为固以滤纸为载体，是以滤纸纤维及其结合水作为固定相，以有机溶剂作为流动相的分配色谱分离。纸上色谱分离定相，以有机溶剂作为流动相的分配色谱分离。纸上色谱分离具有设备简单、操作方便、分离效率高、所需样品量少等优点，具有设备简单、操作方便、分离效率高、所需样品量少等优点，但分离量少、回收困难，分离速度慢等；但分离量少、回收困难，分离速度慢等；u薄层色谱分离薄层色谱分离 ，将固定相在玻璃平板上铺成薄层而进行分将固定相在玻璃平板上铺成薄层而进行分离
21、的一种分离技术。薄层色谱是柱色谱和纸上色谱两者的结合。离的一种分离技术。薄层色谱是柱色谱和纸上色谱两者的结合。2.按固定相形状不同分类按固定相形状不同分类3.3.按照展开程序分类按照展开程序分类 按按照照展展开开程程序序的的不不同同，可可将将色色谱谱法法分分为为洗脱法、顶替法和迎头法洗脱法、顶替法和迎头法。n n洗脱法也称冲洗法洗脱法也称冲洗法洗脱法也称冲洗法洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将样品加到色工作时，首先将样品加到色工作时，首先将样品加到色工作时，首先将样品加到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分
22、弱谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。流出曲线后次序也不同，从而使组分彼此分离。流出曲线后次序也不同，从而使组分彼此分离。流出曲线后次序也不同，从而使组分彼此分离。流出曲线下图。下图。这种方法能使样品的各组分获得良好的分这种
23、方法能使样品的各组分获得良好的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，可获得纯度较高的物质。目前，这种方法可获得纯度较高的物质。目前，这种方法是色谱法中最常用的一种方法。是色谱法中最常用的一种方法。n n顶替法顶替法顶替法顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直接
24、用顶替剂作流动相）分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相）分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相）分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强，通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强，通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强，通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。很明显，吸附或溶弱顺序，依次顶替出固定相。很明显，吸附或溶弱顺序，依次顶替出固定相。很明显，吸附或溶弱顺序，依次顶替出固定相。很明显，吸附或溶解能力最弱的组分最先流出，最强的最后流出。解能力最弱的组分最先流出，最强的最后流出。解能力最弱的组分最先流出，最强
25、的最后流出。解能力最弱的组分最先流出，最强的最后流出。顶替法的流出曲线如下图。顶替法的流出曲线如下图。顶替法的流出曲线如下图。顶替法的流出曲线如下图。此法适于制备纯物质或浓缩分离某一组分；此法适于制备纯物质或浓缩分离某一组分；其缺点是经一次使用后，柱子就被样品或其缺点是经一次使用后，柱子就被样品或顶替剂饱和，必须更换柱子或除去被柱子顶替剂饱和，必须更换柱子或除去被柱子吸附的物质后，才能再使用。吸附的物质后，才能再使用。第三节.生物工程中色谱分离n n电泳和色谱是目前两种最好的分离方法n n 电泳不能用于生产规模n n一 色谱的分离规模n n1.色谱分析：10mgn n2.半制备（中等规模制备）
26、：10-50mgn n3.制备（样品制备）：0.1-10gn n4.工业生产：20g/dn n 干扰素：1万元/1mg，年产值达1亿元（二）色谱分离方法的选择n n初级代谢产物n n 氨基酸、核苷酸、单糖类、脂肪酸n n 次级代谢产物n n 生物碱、糖苷、色素、抗生素n n 生物大分子n n 蛋白质、酶、多肽、核酸、多糖等对于蛋白质、酶、核酸等生物大分子，由于它们分子量大、对于蛋白质、酶、核酸等生物大分子，由于它们分子量大、易失活以及具有生物专一和亲合性等特点，选用多糖基质（如易失活以及具有生物专一和亲合性等特点，选用多糖基质（如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等）离子交换色谱、疏水作用色谱、纤维素、葡
27、聚糖、琼脂糖等）离子交换色谱、疏水作用色谱、凝胶色谱和亲合色谱等；凝胶色谱和亲合色谱等；对于生物小分子的代谢物，由于它们分子量小、结构和性质对于生物小分子的代谢物，由于它们分子量小、结构和性质比较稳定、操作条件不太苛刻，采用吸附、分配和离子交换色比较稳定、操作条件不太苛刻，采用吸附、分配和离子交换色谱进行分离较为适宜。谱进行分离较为适宜。二、色谱分离方法的选择二、色谱分离方法的选择氨基酸、有机酸、核苷酸等一些离子型化合物的生产多氨基酸、有机酸、核苷酸等一些离子型化合物的生产多用离子交换色谱分离；用离子交换色谱分离；抗生素、生物碱、萜类、色素等次级代谢产物多采用吸抗生素、生物碱、萜类、色素等次级
28、代谢产物多采用吸附色谱或反相分配色谱分离。附色谱或反相分配色谱分离。第四节.色谱分离的基本原理n n各组分和固定相存在一定的化学亲和力 移动速度低于流动相n n 各组分和固定相的亲和力大小不同 各组分移动速度不同n n 展开（Development）n n 洗脱液（Eluate）n n 色谱（Chromatography）（一）分配色谱（一）分配系数（一）分配系数K K和分配比和分配比k k1.1.1.1.分配系数分配系数分配系数分配系数K K K K 分分分分配配配配色色色色谱谱谱谱的的的的分分分分离离离离是是是是基基基基于于于于样样样样品品品品组组组组分分分分在在在在固固固固定定定定相相相
29、相和和和和流流流流动动动动相相相相之之之之间间间间反反反反复复复复多多多多次次次次的的的的分分分分配配配配过过过过程程程程，这这这这种种种种分分分分离离离离过过过过程程程程经经经经常常常常用用用用样样样样品品品品分分分分子子子子在在在在两两两两相相相相间间间间的的的的分分分分配配配配来来来来描描描描述述述述，而而而而描描描描述述述述这这这这种分配的参数称为分配系数种分配的参数称为分配系数种分配的参数称为分配系数种分配的参数称为分配系数K K K K。它它它它是是是是指指指指在在在在一一一一定定定定温温温温度度度度和和和和压压压压力力力力下下下下，组组组组分分分分在在在在固固固固定定定定相相相相
30、和和和和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即即即即 K=K=K=K=溶质在固定相中的浓度溶质在固定相中的浓度溶质在固定相中的浓度溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度溶质在流动相中的浓度溶质在流动相中的浓度溶质在流动相中的浓度=C C C Cs s s s/C C C Cm m m m 分配系数是由组分和固定相的热力学性质决分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的，它是每一个溶质的特征值，它仅与定的，它是每一个溶质的特征值，它仅与两个变量有关：两个变量有关：固定相和温度固定相和温
31、度。与两相体。与两相体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关。积、柱管的特性以及所使用的仪器无关。n n阻滞因子阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0 Kd=0）的迁移）的迁移率之比率之比uu其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小小2.分配比分配比 k 分配比又称容量因子，它是指在一定温分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即分配在固
32、定相和流动相中的质量比。即 k k=组分在固定相中的质量组分在固定相中的质量组分在固定相中的质量组分在固定相中的质量/组分在流动相中的质量组分在流动相中的质量组分在流动相中的质量组分在流动相中的质量 =m ms s/m mm m k k k k值值值值越越越越大大大大，说说说说明明明明组组组组分分分分在在在在固固固固定定定定相相相相中中中中的的的的量量量量越越越越多多多多，相相相相当当当当于于于于柱柱柱柱的的的的容容容容量量量量大大大大，因因因因此此此此又又又又称称称称分分分分配配配配容容容容量量量量或或或或容容容容量量量量因因因因子子子子。它它它它是是是是衡衡衡衡量量量量色色色色谱谱谱谱柱柱
33、柱柱对对对对被被被被分分分分离离离离组组组组分分分分保保保保留留留留能能能能力力力力的的的的重重重重要要要要参参参参数数数数。k k k k值值值值也也也也决决决决定定定定于于于于组组组组分分分分及及及及固固固固定定定定相相相相热热热热力力力力学学学学性性性性质质质质。它它它它不不不不仅仅仅仅随随随随柱柱柱柱温温温温、柱柱柱柱压压压压变变变变化化化化而而而而变变变变化化化化，而而而而且且且且还还还还与与与与流流流流动动动动相相相相及及及及固定相的体积有关。固定相的体积有关。固定相的体积有关。固定相的体积有关。k k=m m m ms s s s/m m m mm m m m=C C C Cs
34、s s sV V V VS S S S/C C C Cm m m mV V V Vm m m m 式式式式中中中中c c c cs s s s,c,c,c,cm m m m分分分分别别别别为为为为组组组组分分分分在在在在固固固固定定定定相相相相和和和和流流流流动动动动相相相相的的的的浓浓浓浓度度度度；V V V Vm m m m为为为为柱柱柱柱中中中中流流流流动动动动相相相相的的的的体体体体积积积积，近近近近似似似似等等等等于于于于死死死死体体体体积积积积。VsVsVsVs为为为为柱柱柱柱中中中中固固固固定定定定相相相相的的的的体体体体积积积积，在在在在各各各各种种种种不不不不同同同同的的的的
35、类类类类型型型型的的的的色色色色谱中有不同的含义。谱中有不同的含义。谱中有不同的含义。谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，例如：在分配色谱中，VsVs表示固定液的体积；表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。积。分配比分配比 k k 值可直接从色谱图中测得值可直接从色谱图中测得 k k=(t=(tr rtt0 0)/t)/t0 0=t=t r r/t/t0 0=V=V r r/V/V0 0 4.4.分配系数分配系数K K与分配比与分配比 k k 的关系的关系 K=K=k.k.2色谱法分类n n2.12.1按色谱过程的机理分类按色谱过程的机
36、理分类吸附色谱：吸附色谱：利用各组分在吸附剂与洗脱剂之间的吸附和溶利用各组分在吸附剂与洗脱剂之间的吸附和溶 解（解吸）能力的差异而达到分离的。解（解吸）能力的差异而达到分离的。n n分配色谱：分配色谱：利用各组分在两种互不混溶溶剂间的溶解度差异利用各组分在两种互不混溶溶剂间的溶解度差异来达到分离的。来达到分离的。n n离子交换色谱：离子交换色谱：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同 而达到分离的一种色谱方法。而达到分离的一种色谱方法。n n凝胶色谱（排阻色谱）凝胶色谱（排阻色谱）：利用惰性多孔物，如凝胶，对不：利用惰性多孔物，如凝胶，对不 同组分分子的大小而
37、产生不同的滞留作用，以达到分离的色同组分分子的大小而产生不同的滞留作用，以达到分离的色谱方法。谱方法。n n亲和色谱：亲和色谱：利用生物大分子和固定相表面存在某种特异亲和利用生物大分子和固定相表面存在某种特异亲和力，进行选择性分离的一种方法力，进行选择性分离的一种方法 n n2.2按固定相所处的状态分类柱色谱：将固定相颗粒装填在金属或玻璃柱内进行色谱分离。纸色谱：利用滤纸作为固定相进行色谱分离。薄层色谱：把吸附剂粉末做成薄层作为固定相进行色谱分离。3柱色谱n n柱色谱（柱色谱（Column ChromatographyColumn Chromatography）是最常见的色谱分离）是最常见的色
38、谱分离形式，茨维特的色谱实验是一个典型例子。它具有高效、形式，茨维特的色谱实验是一个典型例子。它具有高效、简便和分离容量较大等特点，常用于复杂样品分离和精制简便和分离容量较大等特点，常用于复杂样品分离和精制化合物的纯化。化合物的纯化。n n柱色谱主要有吸附色谱和分配色谱两类。前者常用氧化铝或硅胶为柱填料。n n后者以硅胶、硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收一定量的特殊液体作为固定相。3.1 吸附柱色谱法分离原理n n吸附柱色谱法吸附柱色谱法是利用各组分在吸附剂与洗脱剂之间的吸附是利用各组分在吸附剂与洗脱剂之间的吸附和溶解（解吸）能力的差异而达到分离的。和溶解（解吸）能力的差异而达到分离的。n n当
39、组分分子到达吸附剂表面时，由于吸附剂表面和组分分当组分分子到达吸附剂表面时，由于吸附剂表面和组分分子的相互作用，使组分分子吸附在吸附剂表面。子的相互作用，使组分分子吸附在吸附剂表面。n n当洗脱剂连续通过吸附剂表面时，由于洗脱剂对组分分子当洗脱剂连续通过吸附剂表面时，由于洗脱剂对组分分子的作用力，组分分子会被洗脱剂溶解下来，在一定的温度的作用力，组分分子会被洗脱剂溶解下来，在一定的温度下，吸附和溶解达到平衡。下，吸附和溶解达到平衡。n n但由于洗脱剂不断地移动，这种吸附和溶解过程会反复发但由于洗脱剂不断地移动，这种吸附和溶解过程会反复发生并建立新的平衡，组分分子就随洗脱剂移动，移动速度生并建立
40、新的平衡，组分分子就随洗脱剂移动，移动速度与组分分子的平衡常数和洗脱剂的流速有关。与组分分子的平衡常数和洗脱剂的流速有关。n n当流速一定时，各组分就依据吸附平衡常数的不同而得到当流速一定时，各组分就依据吸附平衡常数的不同而得到分离。分离。3.2 吸附色谱柱填料n n在吸附色谱色谱中，为了使试样中各种在吸附能力稍有差异的组分能够分开，必须选择适当的固定相（吸附剂）和流动相（洗脱剂）。n n吸附剂的选择主要根据吸附剂性质和分析要求通过实验来现在。n n对吸附剂的一般要求：对吸附剂的一般要求：n n具有较大的表面积和足够的吸附能力具有较大的表面积和足够的吸附能力n n对不同组分有不同的吸附能力对不
41、同组分有不同的吸附能力n n化学惰性，即不溶于流动相，不与样品组分和流动相起化化学惰性，即不溶于流动相，不与样品组分和流动相起化 学反应学反应 颗粒均匀，具有一定的机械强度的粒度颗粒均匀，具有一定的机械强度的粒度一般采用白色或无色吸附剂，便于观察实验一般采用白色或无色吸附剂，便于观察实验 n n常用的吸附剂硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、纤维素等。常用的吸附剂硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、纤维素等。n n（1）硅胶色谱硅胶是由弹性多聚硅酸脱水制成，其吸附中心是硅醇基。n n硅酸性能稳定，是带有微弱酸性的极性吸附剂，特别是它具有很好的惰性、吸附容量大、容易制成各种不同尺寸的颗粒。n n硅胶可用于分
42、离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸、萜类和甾体等。n n（2 2）氧化铝氧化铝色谱氧化铝色谱氧化铝由氢氧化铝在由氢氧化铝在300-400300-400时脱水制得，时脱水制得，它吸附能力比硅胶强。它吸附能力比硅胶强。n n氧化铝氧化铝通常中性、酸性和碱性三种。通常中性、酸性和碱性三种。n n在实际使用中，在实际使用中，酸性氧化铝酸性氧化铝（pH4-5pH4-5）主要用于有）主要用于有机酸、某些酯类、酸性多肽类、酸性色素等化合机酸、某些酯类、酸性多肽类、酸性色素等化合物的分离。物的分离。n n碱性氧化铝碱性氧化铝（）主要用于碱性化合物的分离。（）主要用于碱性化合物的分离。中中性氧化铝性氧化铝用于生
43、物碱类、挥发油、萜类、油脂、用于生物碱类、挥发油、萜类、油脂、树脂、皂甙类以及酸性、碱性氧化铝可分离的化树脂、皂甙类以及酸性、碱性氧化铝可分离的化合物。合物。硅胶和氧化铝的吸附活性n n硅胶和氧化铝硅胶和氧化铝的吸附能力与其含水量有关。通过加热方式的吸附能力与其含水量有关。通过加热方式除去吸附水，可提高吸附剂的吸附活性。除去吸附水，可提高吸附剂的吸附活性。n n一般通过实验测定，将硅胶和氧化铝的活性分为五级一般通过实验测定，将硅胶和氧化铝的活性分为五级（-）。）。级硅胶级硅胶的含水量最少，它的活性最高，对的含水量最少，它的活性最高，对极性化合物的吸附能力最强。极性化合物的吸附能力最强。吸附剂活
44、度与含水量的关系吸附剂活度与含水量的关系 n n氧化铝氧化铝硅胶硅胶n n0000n n3535n n615615n n10251025n n15381538(4)聚酰胺n n色谱用聚酰胺是白色多孔性的非晶形粉末，它不溶于水及甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、苯等有机溶剂；n n对碱比较稳定，对酸的稳定性较差。n n聚酰胺分子内存在很多的酰胺键，它与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键，可对这些化合物进行吸附分离。（5）吸附剂的选择n n在分离极性较强的化合物时，一般选用活性较小的吸附剂。n n而分离极性较弱的化合物时，就选用活性较大的吸附剂。n n极性吸附剂选择性地吸附不饱和的、芳香族的和极性
45、分子。n n非极性吸附剂如活性炭、硅藻土对极性分子无吸附能力。3.3吸附色谱洗脱剂n n流动相的洗脱作用流动相的洗脱作用实质上是洗脱剂分子与样品组分竞争占实质上是洗脱剂分子与样品组分竞争占据吸附剂表面活性中心的过程。据吸附剂表面活性中心的过程。n n为了要使试样中吸附能力稍有差异的各种组分分离，应根为了要使试样中吸附能力稍有差异的各种组分分离，应根据试样的性质，吸附剂的活性，选择适当极性的洗脱剂。据试样的性质，吸附剂的活性，选择适当极性的洗脱剂。化合物极性与其结构有关。化合物极性与其结构有关。n n按结构的特征，各种有机物的极性大小顺序为：按结构的特征，各种有机物的极性大小顺序为：烷烃烷烃 烯
46、烃烯烃 醚类醚类 硝基化合物硝基化合物 酯类酯类 酮类酮类 醛类醛类 胺胺类类 醇类醇类 酚类酚类 酸类酸类n n常用溶剂的极性大小顺序为常用溶剂的极性大小顺序为：石油醚石油醚 环己烷环己烷 四氯化碳四氯化碳 苯苯 乙醚乙醚 乙酸乙酯乙酸乙酯 丙酮丙酮 乙醇乙醇 水水n n在进行吸附柱色谱分离时，应根据样品的性质、吸附剂的性能、流动相的极性三方面的影响因素加于选择。n n一般的选择规律是：样品极性较大，在极性吸附剂柱上进行分离，则应选用吸附性较弱（即活性较低）的吸附剂，用极性较大的溶剂进行洗脱。n n组分的极性较弱，就应选用吸附性较强（即活性较高）的吸附剂，用极性较小的溶剂进行洗脱。样品、吸附
47、剂和洗脱剂的极性关系3.4分配柱色谱分离原理n n分配色谱分配色谱是利用各组分在两种互不混溶溶剂间是利用各组分在两种互不混溶溶剂间的溶解度差异来达到分离的。的溶解度差异来达到分离的。n n在分配柱色谱分离时，这两种互不混溶的溶剂之在分配柱色谱分离时，这两种互不混溶的溶剂之一是流动相；另一种是吸收在载体或担体中的溶一是流动相；另一种是吸收在载体或担体中的溶剂，例如，含有一定量水分的硅胶，其所含的水剂，例如，含有一定量水分的硅胶，其所含的水分可作为固定相。分可作为固定相。n n当流动相带着试样中的各种组分通过色谱柱时，当流动相带着试样中的各种组分通过色谱柱时，样品组分就在流动相和固定相之间进行多次
48、反复样品组分就在流动相和固定相之间进行多次反复分配，当不同的组分分配系数有差异时，它们以分配，当不同的组分分配系数有差异时，它们以不同的迁移速度通过色谱柱得以分离。不同的迁移速度通过色谱柱得以分离。3.5分配柱色谱的固定相和流动相n n常用的载体有硅藻土型、硅胶型、纤维素和高分常用的载体有硅藻土型、硅胶型、纤维素和高分子聚合物型等；使用的固定相多是一些极性较强子聚合物型等；使用的固定相多是一些极性较强的溶剂，如水及各种水溶液，甲醇、甲酰胺等。的溶剂，如水及各种水溶液，甲醇、甲酰胺等。常用的流动相溶剂有：石油醚、醇类、酮类、常用的流动相溶剂有：石油醚、醇类、酮类、酯类、卤代烷烃和苯等以及它们的混
49、合物。在实酯类、卤代烷烃和苯等以及它们的混合物。在实际工作中，为了防止色谱过程中流动相把吸附于际工作中，为了防止色谱过程中流动相把吸附于载体上的少量水分带走，流动相应预先以水饱和，载体上的少量水分带走，流动相应预先以水饱和，并应加入醋酸、氨水等弱酸、弱碱，以防止某些并应加入醋酸、氨水等弱酸、弱碱，以防止某些被分离组分离解。被分离组分离解。3.7柱色谱实验技术n n分配柱色谱法分离速度较慢，处理量小，温度的分配柱色谱法分离速度较慢，处理量小，温度的影响较大，因此能用吸附柱色谱分离的试样总是影响较大，因此能用吸附柱色谱分离的试样总是尽量采用吸附柱色谱法来解决。尽量采用吸附柱色谱法来解决。柱色谱实验
50、技术包括柱子的准备、固定相和柱色谱实验技术包括柱子的准备、固定相和流动相的选择、加样和洗脱、组分收集和鉴定等流动相的选择、加样和洗脱、组分收集和鉴定等步骤。每一步操作都会给分离带来影响，因此，步骤。每一步操作都会给分离带来影响，因此，要使混合物得到良好分离，必须根据实验原理仔要使混合物得到良好分离，必须根据实验原理仔细进行操作。细进行操作。n n1 1）装柱装柱根据样品量和分析要求选择分离柱。常用直径和长度根据样品量和分析要求选择分离柱。常用直径和长度比为比为1:10-1:501:10-1:50玻璃管，下端用玻璃丝塞住或固定一砂芯玻璃管，下端用玻璃丝塞住或固定一砂芯板。样品量和吸附剂之比，通常