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1、会计学1Gateway载体载体(zit)构建系统构建系统第一页，共13页。主要主要(zhyo)内容内容n n什么是Gateway技术n nGateway克隆原理n nGateway技术的特点n nGateway技术的改进(gijn)与发展第1页/共13页第二页，共13页。为什么要构建为什么要构建Gateway载体载体(zit)系统？系统？传统的酶切连接方法的缺陷传统的酶切连接方法的缺陷 1、需要繁琐的酶切连接，工作量大，、需要繁琐的酶切连接，工作量大，难难 以满足大规模克隆的需要。以满足大规模克隆的需要。2、往往难以找到合适的酶切位点而、往往难以找到合适的酶切位点而面临诸多面临诸多(zhdu)
2、的技术困难，影响实的技术困难，影响实验的效率。验的效率。第2页/共13页第三页，共13页。Gateway克隆克隆(k ln)（通路克隆（通路克隆(k ln)）Gateway克隆技术是一个高效的大规模克隆系统，由Invitrogen公司开发。该技术利用噬菌体的位点特异性重组(噬菌体用此重组系统进行裂解途径和溶原途径之间的互相转换)，实现了不需要传统酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移，同时(tngsh)还保持正确的ORF和插入方向。第3页/共13页第四页，共13页。n n基于基于基于基于噬菌体位点特异噬菌体位点特异噬菌体位点特异噬菌体位点特异(ty)(ty)(ty)(ty)性的重组主要涉及
3、性的重组主要涉及性的重组主要涉及性的重组主要涉及两个成分：两个成分：两个成分：两个成分：n n 1 1 1 1、DNADNADNADNA重组序列重组序列重组序列重组序列 即即即即attattattatt位点（包括位点（包括位点（包括位点（包括att B att B att B att B、att P att P att P att P、att L att L att L att L、att Ratt Ratt Ratt R）n n 重组反应就是发生在这些特异重组反应就是发生在这些特异重组反应就是发生在这些特异重组反应就是发生在这些特异(ty)(ty)(ty)(ty)的的的的attattatta
4、tt位点上，重组反应中交换位点实际上只是发生位点上，重组反应中交换位点实际上只是发生位点上，重组反应中交换位点实际上只是发生位点上，重组反应中交换位点实际上只是发生在两个位点核心的在两个位点核心的在两个位点核心的在两个位点核心的15bp15bp15bp15bp同源区域，不过核心外围的同源区域，不过核心外围的同源区域，不过核心外围的同源区域，不过核心外围的序列也是不可或缺的，它们含有重组蛋白的结合位序列也是不可或缺的，它们含有重组蛋白的结合位序列也是不可或缺的，它们含有重组蛋白的结合位序列也是不可或缺的，它们含有重组蛋白的结合位点。点。点。点。n n 2 2 2 2、介导重组反应的蛋白（克隆酶混
5、合物）、介导重组反应的蛋白（克隆酶混合物）、介导重组反应的蛋白（克隆酶混合物）、介导重组反应的蛋白（克隆酶混合物）n n BP BP BP BP克隆酶混合物：克隆酶混合物：克隆酶混合物：克隆酶混合物：噬菌体整合酶（噬菌体整合酶（噬菌体整合酶（噬菌体整合酶（IntIntIntInt）、）、）、）、大肠杆菌整合宿主因子（大肠杆菌整合宿主因子（大肠杆菌整合宿主因子（大肠杆菌整合宿主因子（IHFIHFIHFIHF）n n LR LR LR LR克隆酶混合物：克隆酶混合物：克隆酶混合物：克隆酶混合物：噬菌体整合酶（噬菌体整合酶（噬菌体整合酶（噬菌体整合酶（IntIntIntInt）、）、）、）、切除酶（
6、切除酶（切除酶（切除酶（XisXisXisXis）、大肠杆菌整合宿主因子（）、大肠杆菌整合宿主因子（）、大肠杆菌整合宿主因子（）、大肠杆菌整合宿主因子（IHFIHFIHFIHF）第4页/共13页第五页，共13页。Gateway克隆克隆(k ln)原理原理Gateway技术(jsh)由两个基本反应组成：BP反应 LR反应 通过BP反应(attBattP)得入门克隆(Entry clone)后，再通过LR反应(attLattR)将目的DNA以正确的方向连接到各种目的载体上(Destination vector).其基本过程可以表示为:attBXattPattLXattR第5页/共13页第六页，共1
7、3页。BP反应反应(fnyng)BP BP 反应是利用反应是利用BP BP 克隆酶混和物催化一个带有克隆酶混和物催化一个带有 attB attB 位点的位点的 DNA DNA 片段或表达克隆和一个带有片段或表达克隆和一个带有attP attP 位点的供载体位点的供载体(donor (donor vector)vector)之间的重组反应，把目的片段及其两端部分位点转移之间的重组反应，把目的片段及其两端部分位点转移至供载体中，创建一个入门克隆，其结构为至供载体中，创建一个入门克隆，其结构为 attL1-attL1-基因基因-attL2-attL2。同时，供载体中的同时，供载体中的 ccdB cc
8、dB 细胞死亡控制基因及其两端部分位点细胞死亡控制基因及其两端部分位点被置换出来被置换出来(ch li)(ch li)，单独或融合到表达载体中而形成副产物。，单独或融合到表达载体中而形成副产物。第6页/共13页第七页，共13页。LR反应反应(fnyng)LR LR 反应是利用反应是利用 LR LR克隆酶混和物催化一个带有克隆酶混和物催化一个带有 attL attL 位点的入位点的入门克隆和一个带有门克隆和一个带有 attR attR 位点的目的载体之间的重组反应，使位点的目的载体之间的重组反应，使目的片段及其两端部分位点取代目标载体目的片段及其两端部分位点取代目标载体(destination(
9、destination vector)vector)的的 ccdB ccdB 基因基因(jyn)(jyn)及其两端部分位点而产生最及其两端部分位点而产生最终的表达克隆，其结构为终的表达克隆，其结构为 attB1-attB1-基因基因(jyn)-attB2(jyn)-attB2。副产。副产物为带有物为带有 attP attP 位点的供载体。位点的供载体。第7页/共13页第八页，共13页。首先首先首先首先LRLRLRLR克隆酶识别克隆酶识别克隆酶识别克隆酶识别attLattLattLattL和和和和attRattRattRattR位点，然后在载体的融合一分解、位点结构位点，然后在载体的融合一分解、
10、位点结构位点，然后在载体的融合一分解、位点结构位点，然后在载体的融合一分解、位点结构(jigu)(jigu)(jigu)(jigu)重新分配过程中，重新分配过程中，重新分配过程中，重新分配过程中，入口克隆入口克隆入口克隆入口克隆(Entry clone)(Entry clone)(Entry clone)(Entry clone)中的目的基因及其两头的黑色部分中的目的基因及其两头的黑色部分中的目的基因及其两头的黑色部分中的目的基因及其两头的黑色部分attLattLattLattL位点位点位点位点,取代目标载体取代目标载体取代目标载体取代目标载体(Destination(Destination(
11、Destination(Destination vector)vector)vector)vector)的的的的ccdBccdBccdBccdB基因及其两头的灰色部分基因及其两头的灰色部分基因及其两头的灰色部分基因及其两头的灰色部分attRattRattRattR位点，形成表达克隆位点，形成表达克隆位点，形成表达克隆位点，形成表达克隆(Expression clone)(Expression clone)(Expression clone)(Expression clone)。此时，紧靠目。此时，紧靠目。此时，紧靠目。此时，紧靠目的基因的黑色部分的基因的黑色部分的基因的黑色部分的基因的黑色部分
12、attLattLattLattL位点与远离位点与远离位点与远离位点与远离ccdBccdBccdBccdB基因的黑色部分基因的黑色部分基因的黑色部分基因的黑色部分attRattRattRattR位点重组，形成位点重组，形成位点重组，形成位点重组，形成attBattBattBattB位点位点位点位点;余下的灰色部分余下的灰色部分余下的灰色部分余下的灰色部分重组形成重组形成重组形成重组形成attPattPattPattP位点。位点。位点。位点。BP BP BP BP反应与反应与反应与反应与LRLRLRLR反应相反，重组蛋白组成的反应相反，重组蛋白组成的反应相反，重组蛋白组成的反应相反，重组蛋白组成的
13、BPBPBPBP克隆酶混和物催化表达载体克隆酶混和物催化表达载体克隆酶混和物催化表达载体克隆酶混和物催化表达载体attBattBattBattB间的目间的目间的目间的目的基因转到供载体中，形成新的人口克隆，此克隆又可与其它目标载体重组产生新的表达载体。的基因转到供载体中，形成新的人口克隆，此克隆又可与其它目标载体重组产生新的表达载体。的基因转到供载体中，形成新的人口克隆，此克隆又可与其它目标载体重组产生新的表达载体。的基因转到供载体中，形成新的人口克隆，此克隆又可与其它目标载体重组产生新的表达载体。第8页/共13页第九页，共13页。上下游引物中分别加入attB序列，产物与含有attP位点的载体
14、重组(zhn z)，进行PCR产物的直接克隆第9页/共13页第十页，共13页。Gateway技术技术(jsh)的特的特点点1 1、可以快速而高效的实现、可以快速而高效的实现DNADNA序列序列在多种载体在多种载体(zit)(zit)系统的转移，系统的转移，同时保证正确的方向和阅读框。同时保证正确的方向和阅读框。2 2、对载体、对载体(zit)(zit)和宿主没有依和宿主没有依赖性。赖性。3 3、可使用并表达来自多种类型的、可使用并表达来自多种类型的DNADNA序列，如序列，如PCRPCR产物、产物、cDNAcDNA克隆、克隆、酶切片段等。酶切片段等。4 4、适合于将大量的、适合于将大量的DNA
15、DNA序列转移到序列转移到各种不同的表达载体各种不同的表达载体(zit)(zit)上。上。5 5、系统通用。可以通过添加、系统通用。可以通过添加GatewayGateway盒轻易地将自己感兴趣的盒轻易地将自己感兴趣的载体载体(zit)(zit)改造成改造成GatewayGateway目目的载体的载体(zit)(zit)。第10页/共13页第十一页，共13页。Gateway克隆技术的改进克隆技术的改进(gijn)与与发展发展n nGatewayGateway载体引进载体引进ccdBccdB基因作为重组克隆的负筛选，有效地避免传统酶切连基因作为重组克隆的负筛选，有效地避免传统酶切连接中由于自连载体
16、的转化等因素造成的假阳性现象，大大提高了筛选效率，接中由于自连载体的转化等因素造成的假阳性现象，大大提高了筛选效率，但由于但由于ccdBccdB基因是毒性基因，所以限制了其在实验室之外其他领域的应用。基因是毒性基因，所以限制了其在实验室之外其他领域的应用。n nInvitrogen Invitrogen 公司对公司对 Gateway Gateway 克隆系统进行克隆系统进行(jnxng)(jnxng)改进改进,形成了形成了 N-N-和和 C-C-端端 Gateway Gateway 克隆系统。即利用克隆系统。即利用 PCR PCR 技术分别扩增两个片段技术分别扩增两个片段,这两个片段的这两个片
17、段的N-N-端端和和C-C-端分别含有端分别含有attB1attB1和和attB2attB2位点位点,而他们的而他们的C-C-端和端和N-N-端含有一段相同的序列。端含有一段相同的序列。这样当与含有这样当与含有attP1attP1和和attP2attP2的载体混合后的载体混合后,在在attBattB和和attPattP之间发生位点特异性重之间发生位点特异性重组组,而在两个而在两个PCR PCR 产物之间发生同源重组。这样就使两个片段与载体构建成产物之间发生同源重组。这样就使两个片段与载体构建成一个含有嵌合基因的质粒。一个含有嵌合基因的质粒。n n于于20042004年推出的年推出的Rec-Jo
18、in Rec-Join 专利克隆技术是对专利克隆技术是对 Gateway Gateway技术的一个发展。即目的技术的一个发展。即目的基因与目的载体的结合处一端采用基因与目的载体的结合处一端采用 Gateway Gateway重组的方法：即目的载体一端保重组的方法：即目的载体一端保留留attRattR位点位点;另一端采用经典克隆的方法，即另一端另一端采用经典克隆的方法，即另一端 attR attR位点被替换成酶切位位点被替换成酶切位点的序列，克隆的步骤大致为点的序列，克隆的步骤大致为“酶切酶切 连接连接 重组重组”。n n 第11页/共13页第十二页，共13页。Thanks!第12页/共13页第十三页，共13页。