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1、标准的标准的 PCRPCR 实验室简介实验室简介1 1、主体结构：主体结构：主体为彩钢板、铝合金型材。室内所有阴角、阳角均采用铝合金主体为彩钢板、铝合金型材。室内所有阴角、阳角均采用铝合金5050 内圆角铝，从而解决容内圆角铝，从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。结构牢固，线条简明，美观大方，密封性好。易污染、积尘、不易清扫等问题。结构牢固，线条简明，美观大方，密封性好。2 2、标准的三区分隔和气压调节：标准的三区分隔和气压调节：将将 PCRPCR 过程分成试剂准备、标本制备和过程分成试剂准备、标本制备和 PCRPCR 扩增检测三个独立的实验区。整个区域有一个扩增检测三个独立的实验区。整个
2、区域有一个整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区，整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区，同时各区通过气压调节，使整个同时各区通过气压调节，使整个PCRPCR 实验实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。过程中试剂和标本免受气溶胶的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。可打开缓冲区，可打开缓冲区，缓冲区和缓冲区和 PCRPCR 扩增区的排风扇往外排气，扩增区的排风扇往外排气，在实验区的外墙上和各扇门在实验区的外墙上和各扇门上都安装有风量可调的回风口，空气通过回风口向室内换气。上都安装有风量可调的回风口，空气通过回风口向室内换气。3 3、消毒：消毒：在三个实验区
3、和三个缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯，供消毒用。在三个实验区和三个缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯，供消毒用。在试剂准备区和标本制备区在试剂准备区和标本制备区 还设置移动紫外线灯，对实验桌进行局部消毒。还设置移动紫外线灯，对实验桌进行局部消毒。4 4、机械连锁不锈钢传递窗：机械连锁不锈钢传递窗：试剂和标本通过机械连锁不锈钢（不建议使用电子连锁方式）传递窗传递，保证试剂和标试剂和标本通过机械连锁不锈钢（不建议使用电子连锁方式）传递窗传递，保证试剂和标本在传递过程中不受污染（人物分流）。本在传递过程中不受污染（人物分流）。5 5、地面地面地面建议使用地面建议使用 PVCPVC 卷材地面或
4、自流坪地面，整体性好。便于进行清扫，耐腐蚀。没有条件卷材地面或自流坪地面，整体性好。便于进行清扫，耐腐蚀。没有条件的也可采用水磨石地面，或大块的瓷砖（至少的也可采用水磨石地面，或大块的瓷砖（至少 800mm800mm800mm800mm）接缝需要小于）接缝需要小于 2mm2mm。6 6、照明照明灯具要选用净化灯具，能达到便于清洗、不积尘的特点。灯具要选用净化灯具，能达到便于清洗、不积尘的特点。标准的标准的 PCR 实验室实验室在建设的过程中应注意：规范的安装流程和全面的服务流程。规范的安装流程和全面的服务流程。严格按照规范科学设计的安装流程。严格按照规范科学设计的安装流程。安装前需要确定以下安
5、装条件，如：电源电压，电源进线位置，电话网络线进线位置，进安装前需要确定以下安装条件，如：电源电压，电源进线位置，电话网络线进线位置，进水水压，最小安装空间，地面平整度，通风孔、进水管和下水管的位置等，理想状态的空水水压，最小安装空间，地面平整度，通风孔、进水管和下水管的位置等，理想状态的空间尺寸和通风口尺寸。间尺寸和通风口尺寸。PCRPCR 实验室基本要求实验室基本要求PCR 实验室依据所使用的方法可分为试剂准备、标本制备、扩增、产物分析等三或四个区域。只是使用实时荧光 PCR 仪、HIV 病毒载量测定仪的 PCR 实验室，有上述前面三个区域即可。各区域应完全独立分隔，不应有任何的空气直通。
6、标准的标准的 PCRPCR 实验室实验室 产物分析区或三个区域的最后一个区域（即扩增及产物分析区），空气流向应由室外向室内，可通过在室内设置通风橱、排风扇或其他排风系统达到空气流由室外向室内流动的要求。PCR 实验室各区域仪器设备配备通常如下：标准的标准的 PCRPCR 实验室实验室 试剂准备区:仪器设备主要应有加样器、冰箱、天平、低速离心机、混匀器、可移动紫外灯等。可使用超净工作台作为试剂配制操作台面。标准的标准的 PCRPCR 实验室实验室 标本制备区仪器设备主要应有生物安全柜（最好为B2,可避免提取核酸在柜内反复循环，造成标本间交叉“污染”，出现假阳性结果。此外还应配备加样器、台式高速离
7、心机（冷冻及常温）、台式低速离心机、恒温设备（水浴和/或干浴仪）、冰箱、混匀器和可移动紫外灯等。标准的标准的 PCRPCR 实验室实验室 扩增区主要仪器就是核酸扩增热循环仪（PCR 仪，实时荧光或普通的）。热循环仪的电源应专用，并配备一个稳压电源或 UPS，以防止由于电压的波动对扩增测定的影响。此外，根据工作需要，还可配备加样器、超净台等。标准的标准的 PCRPCR 实验室实验室 产物分析区：本区所使用的仪器设备可能有加样器、电泳仪（槽）、电转印仪、杂交炉或杂交箱、水浴箱、DNA 测序仪、酶标仪和洗板机等。在理想情况下，PCR 实验室试剂准备、标本制备、扩增三个区域可设置缓冲间。在缓冲间内，可
8、设置正压，使室内空气不流向室外，室外空气不流向室内。PCRPCR 实验室平面布置示意图实验室平面布置示意图一般实验室间隔材料分:彩钢板,不锈钢板,理化板等,价格依次而上,主要考虑不产尘,不滋菌,容易清理就行一般实验室间隔材料分:彩钢板,不锈钢板,理化板等,价格依次而上,主要考虑不产尘,不滋菌,容易清理就行*卫生部 PCR 研究员李金明(卫生部临床检验中心临床免疫室主任,研究员)的 PCR 建设方案再说吧！国外的资料不一定是最好。个人觉得李金明的实验室区正压（扩增分析区因为没有缓冲，所以为负压），缓冲间负压的作法可以更好的防止气体的外泄及防止试剂准备区、标本制备区、产物扩增区、扩增分析区四区之间
9、的气体相互渗漏。PCR 实验室也可以分为三个区，即第三、四区合为一区，必须设立缓冲间。有条件建设实验室采用三十万级的标准来建设。空调系统采用制冷剂各区独立循环，可以防止气流交叉。*疾病预防控制中心实验室建设之疾病预防控制中心实验室建设之 PCRPCR 实验室基本要求实验室基本要求:PCR 实验室可以是分散形式，也可以是组合形式。完成一组 PCR 实验，通常应经过试剂配制、样品处理、核酸扩增及产物分析四个实验过程，若实验工艺需要，还应增加样品粉碎过程。一、分散形式 PCR 实验室所谓分散形式 PCR 实验室，是指完成上述实验过程的实验用房彼此相距较远，呈分散布置形式。对于这种布置形式的PCR 实
10、验室，由于各个实验之间不易相互干扰，因此无需特殊条件要求。二、组合形式 PCR 实验室所谓组合形式 PCR 实验室,是指完成 PCR 四个实验过程的实验用房相邻布置，组成独立实验区域的形式。对于组合形式PCR 实验室，由于各个实验间集中布置，容易造成相互干扰，因此，对总体布局以及屏障系统具有一定的要求。各室在入口处设缓冲间，各室在入口处设缓冲间，以减少室内外空气交换。试剂配制室及样品处理室宜呈微正压，以防外界含核酸气溶胶的空气进入，造成污染；核酸扩增室及产物分析室应呈微负压，以防含核酸的气溶胶扩散出去污染试剂与样品。如果使用荧光 PCR 仪，扩增室和产物分析室可以合并。若房间进深允许，可设 P
11、CR 内部专用走廊。需要指出的是在减少室内外空气交换方面，缓冲间比专用走廊更有意义。*PCR 实验区的设置，几个要注意的问题：1、几个区域的大小设置情况，应该是试剂准备区、产物扩增区、扩增分析区，要小一些。标本制备区应大一些。因为，标本制备室要放置一个生物安全柜为一个低温冰箱。2、试剂准备区、标本制备区就设立紧急洗眼器，以备不时之需。3、PCR 实验室的洁净度可以根据用户的实际使用情况和资金的投入来设计。*临床基因扩增检验实验室基本设置标准根据临床检验扩增检验实验室管理暂行办法，制定本标准一、临床基因扩增检验实验室区域设置原则（一）临床基因扩增检验实验室区域设置原则1、试剂储存和准备区2、标本
12、制备区3、扩增反应混合物配制和扩增区4、扩增产物分析区如使用全自动分析仪，区域可适当合并。（二）各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。（三）进入各工作区域必须严格按照单一方向进行，即试剂储存和准备区 标本制备区扩增反应混合物配制和扩增区扩增产物分析区。（四）不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。二、工作区域仪器设备配置标准（一）试剂储存和准备区1、2-8C 和-15C 冰箱2、混匀器3、微量加样器（覆盖1-1000ul）4、移动紫外灯（近工作台面）5、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸
13、头（带滤心）6、专用工作服和工作鞋7、专用办公用品（二）标本制备区1、2-8C 冰箱、-20C 或-80C 冰箱2、高速台式冷冻离心机3、混允器4、水浴箱或加热模块5、微量加样器（覆盖1-1000ul）6、可移动紫外灯（近工作台面）7、超净工作台8、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）9、专用工作服和工作鞋10、专用办公用品如需处理大分子 DNA，应具有超声波水浴仪。（三）扩增反应混合物配制和扩增区1、核酸扩增仪2、微量加样器（覆盖 1-1000ul）3、可移动紫外灯（近工作台面）4、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心
14、）5、专用工作服和工作鞋6、专用办公用品(四)扩增产物分析区视检验方法不同而定。基本仪器设备如下：1、微量加样器（覆盖 1-1000ul）2、可移动紫外灯（近工作台面）3、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、加样器吸头（带滤心）4、专用工作服和工作鞋5、专用办公用品为了对以个特定序列进行PCR 做重复检测,需要三个不同的区域,每一个区域的具体技术操作和试剂在下面详细列出.1、样品准备区这个区域专门用作样品的准备，在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施：1）PCR 产物和带有要扩增序列的DNA 克隆不能在这个房间操作。2）组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理，以根据应用的需
15、要提取DNA 或 RNA。3）用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。4）DNA 样品应该用有专门的防护或正压活塞式移液管操作，以防止在吸取样品时有气溶胶遗留。5）大体积样品应该用单独包装的无菌一次性移液管吸取。6）管子打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生，而且管子不能用力崩开，这样会产生气溶胶。7）任何时候都应该穿实验服和带手套，手套要经常更换，尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。实验服要专门用于样品准备间，经常清洗。2、样品准备和 RNA-PCRRNA-PCR 的额外步骤需要额外的样品操作，这样增加了样品之间污染的机会。为了避免这一问题，反转录一步可以在样品准
16、备区进行。在RNA-PCR 中应用 UNG 以防止污染的方法也有报道。3、前 PCR 区必须有专门用于准备各种反应的区域，这个区域必须保持干净，而且没有来自克隆和样品准备的污染。前 PCR 区必须要有试剂和准备，特别是专门用于前PCR 区的正压活塞式移液管。4、PCR 实验室试剂的操作1）所用的所有溶液都应该没有核酸和（或）核酸酶（DNase 和 RNase）污染。2）所有 PCR 试剂中使用的水都应该是高质量的新鲜蒸馏的去离子水，用m 过滤的，并且是高压灭菌。3）在 20到 25贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂，在扩增试剂或样品制备试剂中加入%的叠氮钠不抑制扩增反应。4）所用试剂都
17、应该以大体积配制，实验一下看试剂是否满意，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。5）所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。6）新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。7）样品准备和前 PCR 区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。5、在前 PCR 区建立 PCR 混合物1）可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20或 4，在实验室只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。2）如果你的实验室使用多套引物，以致于配制包括所有试剂的单一反应混合物不够经济，可以考虑分装保存够一天的PCR 成分。3）作为一个规则，应该保存一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品
18、来分析样品配制和 PCR前过程的效率和洁净程度。而且，你也希望通过使用一个已知的弱阳性样品来验证你的样品缓冲液以证明里面不含扩增抑制物。4）阴性样品要与每组样品同时做，以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在PCR 产物的污染，阴性对照应该包括核酸以外的所有试剂。5）当做阳性对照时，有两个理由决定了应该使用最少数量的核酸。6）由于必须有对照反应，对照模板的特点应该予以考虑。6、控制污染的方法已设计出很有力的酶学方法用来消除一种形式的污染使用 UNG，这一技术能有效地消除由 PCR 产物引起的污染。另一种控制污染的方法是使用紫外线，这种方法不能完全消除污染问题，但可以将污染降低几个数量级。7、PCR 仪的位置8、后 PCR 区PCR 完成以后，需要分析样品并解释数据，应该留出一个专门用于反应后处理样品的地方。后 PCR 活动中使用的所用试剂、一次性耗材和仪器都必须是专门用于这一目的，决不能把实验室这一区域的试剂或仪器用于任何前PCR 活动