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1、-第二节RNA 转录后的加工与修饰不论原核或真核生物的 rRNAs 都是以更为复杂的初级转录本形式被合成的，然后再加工成为成熟的RNA 分子。然而绝大多数原核生物转录和翻译是同时进行的，随着 mRNA 开始的 DNA 上合成，核蛋白体即附着在 mRNA 上并以其为模板进行蛋白质的合成，因此原核细胞的 mRNA 并无特殊的转录后加工过程，相反，真核生物转录和翻译在时间和空间上是分天的，刚转录出来的mRNA 是分子很大的前体，即核内不均一 RNA。hnRNA 分子中大约只有 10%的部分转变成成熟的 mRNA，其余部分将在转录后的加工过程中被降解掉。（一）mRNA 的加工修饰原核生物中转录生成的
2、mRNA 为多顺反子，即几个结构基因，利用共同的启动子和共同终止信号经转录生成一条 mRNA，所以此 mRNA 分子编码几种不同的蛋白质。例如乳糖操纵子上的 Z、Y 及 A 基因，转录生成的 mRNA 可翻译生成三种酶，即半乳糖苷酶，透过酶和乙酰基转移酶。原核生物中没有核模，所以转录与翻译是连续进行的，往往转录还未完成，翻译已经开始了，因此原核生物中转录生成的mRNA 没有特殊的转录后加工修饰过程。真核生物转录生成的 mRNA 为单顺反子，即一个 mRNA 分子只为一种蛋白质分子编码。真核生物 mRNA 的加工修饰，主要包括对 5端和 3端的修饰以及对中间部分进行剪接。1在 5端加帽成熟的真核
3、生物 mRNA，其结构的 5端都有一个 m7G-PPNmN 结构，该结构被称为甲基鸟苷的帽子。如图 17-9 所示。鸟苷通过 5-5焦磷酸键与初级转录物的 5端相连。当鸟苷上第 7 位碳原子被甲基化形成m7G-PPNmN 时，此时形成的帽子被称为“帽0”，如果附m7G-PPNmN 外，这个核糖的第“2”号碳上也甲基化，形成 m7G-PPNm，称为“帽 1”，如果 5末端 N1 和 N2 中的两个核糖均甲基化，成为 m7G-PPNmPNm2，称为“帽 2”。从真核生物帽子结构形成的复杂可以看出，生物进化程度越高，其帽子结构越复杂。图 17-9Post-transcriptional modifi
4、cation of mRNa showing the 7-methylguanosine cap and poly-A tail.真核生物 mRNA 5端帽子结构的重要性在于它是 mRNa 做为翻译起始的必要的结构，对核糖体对mRNA 的识别提供了信号，这种帽子结构还可能增加 mRNA 的稳定性，保护 mRNa 免遭 5外切核酸酶的攻击。2在 3端加尾大多数的真核 mRNA 都有 3端的多聚尾巴（A)，多聚（A)尾巴大约为 200bp。多聚（A)屠巴不是由 DNA 编码的，而是转录后在核内加上去的。受 polyA 聚合酶催化，该酶能识别，mRNa 的游离 3-OH 端，并加上约 200 个 A
5、 残基。近年来已知，在大多数真核基因的 3一端有一个 AATAA 序列，这个序列是 mRNa 3-端加 polyA 尾的信号。靠核酸酶在此信号下游 10-15 碱基外切断磷酸二酯键，在 polyA 聚合酶催化下，在3-OH 上逐一引.z.-入 100-200 个 A 碱基。关于 polyA 尾巴的功能问题尽管经过极其广泛的探索，但还不完全清楚。有人推测polyA 可能与 mRNA 从细胞核转送到细胞质有关，但是相当数量，的没有 polyA 屠巴的 mRNA 如组蛋白mRNA，也照样通过核膜进入细胞质。还有人认为这种结构对真核mRNA 的翻译效率具有*种作用，并能稳定 mRNA 结构，保持一定的
6、生物半衰期。3.mRNA 前体（hnRNA）的拼接原核生物的结构基因是连续编码序列，而真核生物基因往往是断裂基因，即编码一个蛋白质分子的核苷酸序列被多个插入片断所隔开，一个真核生物结构基因中内含子的数量，往往与这个基因的大小有关，例如胰岛素是一个很小的蛋白质，它结构基因只有两个内含子，而有些很大的蛋白质，它的结构基因中可以有几十个内含子。经过复杂的过程后，切去内元，将有编码意义的核苷酸片段（E*tron 外元也叫外显子）连接起来（图 17-10）。图 17-10Primary polymerase 11transcript of a eukaryote gene showing(a)intro
7、ns after capping andaddition of polyA tail.(b)E*cision of introns to form the mature mRNA is called splicing.真核生物的结构的基因中具有可表达活性的外显子，也含有无表达活性的内含子，但内含子序列下是无意义的，越来越多的实验证明有许多基因中的内含子参与基因表达调控，在转录时，外显子及内含子均转录到 hnRNA 中。在细胞核中 hnRNA 进行剪接作用，首先在核酸内切酶作用下剪切掉内含子；然后在连接酶作用下，将外显子各部分连接起来，而变为成熟的mRNA，这就是剪接作用，也有少数基因的hnRN
8、A不需进行剪接作用，例如-干扰素基因，图 17-11 以卵清蛋白基因为例，介绍一个典型的转录及加工过程。图 17-11卵清蛋白基因转录及加工过程图中外显示以 1、2、3、4表示，内含子以 A、B、C、D表示mRNA 的拼接，需要在拼接部位有供拼接识别的保守性强的一致顺序，通过对 100 多种真核细胞基因的分析，发现外元和内元拼接部位部分碱基顺序有一定的规律（见表 17-4）。表 174含有内元的转录产物其拼接处的碱基顺序基因区域卵清蛋白内元 2卵清蛋白内元 3-珠蛋白内元 1-珠蛋白内元 2Ig内含子 1SV40 病毒早期 T 抗原E*onUAAG GUGAUCAG GUACGCAG GUUG
9、CAGG GUGAUCAG GUCAUAAG GUAAIntronE*onACAGGUUGUCAGUCUGUCAGGCUGACAGUCUCGCAGGGGCUUAGAUUC表中划线的碱基对拼接识别有重要作用，如将兔的-珠蛋白的拼接部位的 GT 改为 AT 后，拼接反应即受到影响。mRNA 前体拼机制.z.-图 17-12The RNA splicing mechanism.RNA splicing is catalyzed by a spliceosome formed from theassembly of U1,U2,U5,and sn RNPs(shown as green circles
10、)plus other ponents(not shown).After assemblyof the spliceosome,the reaction occures in two speps:in step 1the branch-point A nucleotide in the intronsequence,which is located colse to the 3splice site,attacks the 5splice site and cleaves it;the cut 5end of theintron sequence thereby bees covalently
11、 linked to this A nucleotide,forming the branched nucleotide shownin Figure 8-55.In step 2 the 3-OH end of the first e*on sequence,which was created in the first step,adds tothe beginning of the second e*on sequence,cleqving the RNA molecule at the 3splice site;the two e*onsequences are thereby join
12、ed to each other and the intron sequence is released ad a ribosone.These splicingreactions occur im the nucleus and gengerate mRNa molecules from primary RNA transcripts(mRNAprecursor molecules).mRNA 拼接反应需要有核内小分子 RNA 参与它们与蛋白质形成的复合物称为小核糖核蛋白颗粒，SnRNA 分别被命名为 U1,U2,U3,U4,U5,和 U6RNA。SnRNA 中的 U2RNA 由与内元右端拼
13、接部位附近的UACUAA 顺序高度互补，形成一个环状结构，由特定的酶来识别切除该环状结构，完成拼接过程，如图 17-12所示。图 17-13Mechanim of mRNa splicing.Note that,for clarity,the process is shown in two stages;energy is notrequired for the process since transesterification reactions are involved.真核生物 mRNA 前体在剪接过程中，还可以形成套索样的结构，在内含子序列中常有一个分支部位的腺苷酸残基，它的 2-OH
14、 可以自动攻击内含子 5端与外显子 1 连接的磷酸二酯键，切开了外噗子 1，而腺苷酸原来已有 3，5-磷酸二酯键相连的两个相邻的核苷酸残基，加上此 3，5-磷酸二酯键连接后，在腺苷酸处出现了一个套索，已被切下的外显子 1 的 3-OH 攻击内含子 3末端与外显子 2 之间的 3，5-磷酸二酯键，键断裂后，内含子以套索的形式被节下来，此时外显子 1 和外显子 2 可以连接起来（图 17-13）。不论拼接过程如何，拼接必须极为精确，否则会导致遗传信息传递障碍，合成的蛋白质可能丧失其正常的功能。我国南方广大地区是-地中海贫血的高发区，这是由于-珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制所引起的一种血红蛋白病。
15、实验表明-珠蛋白基因元 1 中核苷酸的点突变改变了正常拼接部位的碱基顺序，结果造成错误部位的拼接。加工成熟的 mRNA 虽能翻译，但产物不是正常的-珠蛋白，结果引起血红蛋白级结构和功能的改变。（二）rRNA 转录后加工原核生物 rRNA 转录后加工，包括以下几方面：rRNA 前体被大肠杆菌 RNase,RNaseE 等剪切成一定链长的 rRNA 分子；rRNA 在修饰酶催化下进行碱基修饰；rRNA 与蛋白质结合形成核糖体的大、小亚基（见图 17-14）图 17-14大肠杆菌 rRNA 前体的加工真核生物rRNA 前体比原核生物大，哺乳动物的初级转录产物为 45s，低等真核生物的 rRNA 前体
16、为38s，真核生物 5sRNA 前体独立于其他三种 rRNA 的基因转录（图 17-15)。图 17-15真核生物 rRNA 前体的加工.z.-真核生物 rRNA 前体中含有插入顺序，rRNA 前体要形成成熟的 rRNA，需要经过拼接反应。例如，四膜虫的 rRNA 前体的拼接是一种无酶催化的自动拼接过程。四膜虫基因组内，26srRNA 编码的区域内有413bp 的插入顺序。该插放序列可以不消耗能量从 rRNA 前体中被除掉。用 SDS 煮沸和用蛋白酶外理等破坏酶活性办法，都不能破坏拼接活性，但反应中 Mg2+和鸟嘌呤核苷酸是必在的。用 32P-GTP 进行追踪实验表明，起始过程是 GTP 在插
17、入顺序 5端发生亲核反应，同时 GMP 与 5端切点的切除段形成磷酸二酯键并使原 RNA 断开。第二步是5切点的外元 3-OH 与 3切点的外元 5-P 共价连接，获得成熟的rRNA，被切除部分最后环化，形成一个环状结构，同时从 5端去掉一个 15 核苷酸啐片。剩余部分连接成 399 核苷酸的环状产物，再经过几步，最后切下一个 19 个核苷酸的线性内含子序列即 L-19，它具有催化活性，上面的剪接作用，是由内含子本身的催化性质决定的（图 17-16）。图 17-16四膜虫 rRNA 前体的自我剪接这种 rRNA 的自身剪接反应给人们一个提示：即 RNA 分子也有酶的催化活性。这向酶的化学本质是
18、蛋白质这一传统概念提出了挑战。这种有酶催化活性的RNA 分子命名为 Ribozyme。T.Cech 和 S.Altman 各自分别发现 RNA 具有催化作用，他们的发现对于了解生命进行过程有重要意义。很可能在原始生命中，RNA所催化的断裂一连接反应是最早出现的催化过程。为此，他们共同获得了 1989 年 Nobel 化学奖。从大多数 Ribozymw 的结构中发现一些特征，例如：锤头状结构的 RNA 分子有 13 个保守的核苷酸序列，如果它们中的碱基改变会使这种催化活性失去作用。根据这种特片，科学家们在体外没计并人工合成这种 RNA 分子，用于抗肿瘤及抗病毒的实验中（图 17-17）。图 17
19、-17锤头结构模式图（三）tRNA 转录后的加工修饰原核生物和真核生物刚转录生成的 tRNA 前体一般无生物活性，需要进行剪切和拼接碱基修饰3-OH 连接-ACC 结构（图 17-18）。图 17-18tRNA 前体的加工tRNA 前体在tRNA 剪切酶的作用下，切成一定在小的 tRNA 分子。大肠杆菌 RNase P可特异剪切tRNA前体的 5旁顺序，因此，该酶被称为 tRNA5成熟酶。除了 RNaseP 外，tRNA 前体的剪切尚需要一个 3-核酸内切酶，这可将 tRNA 前体 3端的一段核苷酸序列切下来。此外 RNaseD 是 tRNA3端成熟酶。近年来的研究表明大肠杆菌 RNaseP
20、是一种非常特殊的酶分子，它是由 RNA 和蛋白质组成，最近发现 RNAaseP 分子中的 RNA 部分在*些条件下，可以单独地催化 tRNA 前体的加工成熟，这个发现和四膜虫tRNA 能自我拼接被认为是近十年来生化领域内最令人鼓舞的发现之一。说明 RNA 分子确具有酶的催化活性。经过剪切后的tRNA 分子还要在拼接酶作用下，将成熟 tRNA 分子所需的片段拼起来。成熟的 tRNA 分子中有许多的稀有碱基，因此 tRNA 在甲基转移酶催化下，*些嘌呤生成甲基嘌呤如AmA,GmA。有些尿嘧啶还原为双氢尿嘧啶。尿嘧啶核苷转变不假尿嘧啶核苷。*些腺苷酸脱氨基为成为次黄嘌呤核苷酸（）3末端加上 CCA：在核苷酸转移酶作用下，3-末端除去个别碱基后，换上 tRNA 分子统一的 CCA-OH末端，完成 tRNA 分子中的氨基酸臂结构。.z.