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1、1.1.前言前言超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，EC 广泛存在于动物、植物和微生物中，是一种能专一地清除超氧阴离子自由基(O2)的金属酶1。按所含金属离子不同可分为CuZnSOD、MnSOD 和FeSOD2。SOD催化反应：2H+2O22H2O2+O2。SOD对过量的O2的及时清除保证了机体内O2的含量相对平衡，对机体起防护作用3。国内外研究表明SOD具有抗炎、抗衰老抗辐射4等重要作用5。我国近年来在植物SOD的研究领域有大量相关进展报道。许平6、袁艺7、赵文芝8、余旭亚9等分别从大蒜、桑叶、沙棘、仙人掌中提取出SOD并进行相关研究。SOD 的制备方法随原料而
2、异，目前国内外制备SOD 的原料有动物血10、微生物和动植物组织。牛血通常不会进行再加工，本文旨在通过牛血中SOD的研究，为牛血SOD的开发利用提供依据。2.2.材料与方法材料与方法材料材料仪器仪器50 ml 离心管，500 ml 烧杯，200 ml 烧杯，电子天平，冷冻离心机，试管，恒温水浴锅，紫外分光光度计，电泳仪，垂直电泳槽，培养皿（染色用），移液器（1000ul、100ul、50ul、10ul），YC-1 层析柜，混合器，恒流泵，紫外检测仪，自动收集装置，记录仪等。材料材料新鲜牛血（购于北京市牛街），Sephadex G-100 凝胶试剂试剂(1)磷酸缓冲液（、L）(2)考马斯亮蓝 G
3、-250 试剂：称取100 mg 考马斯亮蓝 G-250，溶于50 ml 95%乙醇中，加入100 ml 85%的磷酸，蒸馏水定容至1000 ml。此试剂常温下可保存30 天。(3)标准蛋白(BSA)标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清白蛋白25 mg，加蒸馏水溶解并定容至100 ml。吸取上述溶液 40 ml，用蒸馏水稀释至 100 ml，即为 100 ug/ml 的标准蛋白质溶液。(4)SOD 活力测定试剂50 mmol/L pH HCl 缓冲液（Tris，EDTANa2，L HCl 调，定容至 100ml）；45mmol/L 邻苯三酚溶液（用 10 mmol/L 盐酸配制）。10 mmol
4、/L 盐酸。(5)40%蔗糖：称取 40 g 蔗糖加重蒸水 100 ml。(6)10%过硫酸铵(AP)：称过硫酸铵 10g，溶于 100 ml 重蒸水中。用时现配。(7)电极缓冲液：称取 Tris(三羟甲基氨基甲烷)6g，甘氨酸。用蒸馏水溶解并定容至1000 ml。用时稀释 10 倍。(8)胶贮液（30%的 Acr/Bis 溶液）：称丙烯酰胺Acrg，甲叉双丙烯酰胺Bis，加重蒸水溶解，定容至 100ml，过滤后装入棕色瓶，4保存。(9)分离胶缓冲液：Tris（三羟甲基氨基甲烷），加 1 mol/L HCl 48 ml，用浓盐酸调，再用蒸馏水定容至 100 ml。(10)浓缩胶缓冲液：Tris
5、g，加 1 mol/L HCl 48 ml，TEMEDml，用浓盐酸调至后，再用蒸馏水定容至 100 ml。(11)脱色液：乙酸。(12)TEMED方法方法收集红细胞、溶血收集红细胞、溶血取加入抗凝剂的新鲜牛血 300ml，充分摇匀，3000r/min 离心 20min 除去血浆，收集沉淀（红细胞），加入等体积%NaCl 溶液，用玻璃棒搅起充分洗涤，3000r/min 离心 20min，弃去上清液（重复3 次，上层液体为淡黄色），收集洗净的沉淀（红细胞）放入500ml 烧杯中，加入等体积 ddH2O，将烧杯置于冰浴中搅拌溶血30min，得溶血液约200ml，放入YC-1 层析柜中（04）过夜，
6、使红血球充分破裂。沉淀血红蛋白沉淀血红蛋白向溶血液中加入 4下预冷的 95%乙醇（倍体积，50ml），然后再缓慢加入 4下预冷的氯仿（倍体积，30ml），搅拌45min，静置2h，冷冻3500r/min 离心 20min，弃去沉淀（血红蛋白），收集上清液 85ml，此即酶的粗提液。上清继续冷冻3500r/min 离心 20min。SODSOD 富集富集向酶粗提液加入 35g K2HPO43H2O（按 43gK2HPO43H2O：100ml 粗提液的比例），充分搅匀，转移到分液漏斗，震摇后静置 15min，见明显分层。收集含 SOD 上层乙醇-氯仿相（微浑浊，42ml），室温下 3500r/mi
7、n 离心 25min，弃去沉淀，得上清液约。SODSOD 纯化纯化沉淀。沉淀。在上清液中加入等体积4预冷的丙酮 40ml，搅拌均匀，YC-1 层析柜中静置 20min，3500r/min 离心 20min 收集沉淀物。溶解。溶解。向沉淀中加入少量去离子水溶解，4500r/min 离心 20min，合并两次上清，共23ml。热变性热变性11。向溶液中加入 CuCl2H2O（按 40gCuCl2H2O：100L 原血），在 60水浴中保温10min，冷却至室温，4000r/min 离心 20min，弃去沉淀物，收集上清液30ml。再沉淀。再沉淀。在上清液中加入 4 倍体积 4预冷的丙酮，使丙酮含量
8、为 80%，10000r/min 离心10min 收集沉淀。用 2ml 水溶解。装入截留量为 10000 道尔顿的透析袋中，于 LpH 值为的磷酸缓冲液中透析过夜，4000r/min 离心 30min，弃去沉淀物，收集上清液。Sephadex G-100Sephadex G-100 柱层析纯化柱层析纯化12Sephadex G-100 分子筛柱层析(20 cm 2 cm)。用、量浓度为 mmol/L 的磷酸缓冲液平衡洗脱，上样体积为3ml，自动部分收集器收集，控制流速为4 ml/10 min，每管收集 4 ml，分光光度计测定各管 A280 值(牛血 Cu-Zn-SOD 的最大吸收波长为 26
9、0nm，280nm 吸收峰不明显，在此处测定有一定影响)13 13，并测定各管活性，合并活性峰管，冷冻干燥。蛋白质含量测定（微量考马斯亮蓝蛋白质含量测定（微量考马斯亮蓝 G-250G-250 法）法）标准曲线的制作标准曲线的制作取 6 支具塞试管，编号，按表1 加入试剂：表表 1 1微量考马斯亮蓝 G-250 法加样表Micro-Coomassie brilliant blue G-250 method试剂标号蛋白质标准液/ml蒸馏水/ml考马斯亮蓝 G-250/ml蛋白质含量/ug105023456590.0755570.075153盖上塞子，摇匀。注意各管振荡程度尽量一致。放置10 min
10、，在595 nm 波长下比色测定光吸收值，比色应在 l h 内完成。以牛血清白蛋白含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘出标准曲线。样品中蛋白含量的测定样品中蛋白含量的测定将待测的 SOD 溶解并稀释到一定浓度，取 1 支试管，淮确加入 ml 样品提取液，加入 ml蒸馏水和 5 ml 考马斯亮蓝 G-250 试剂，其余操作与标准曲线制作相同（样品有粗酶液、硫酸铵盐析液、Sephadex G-100，DEAE-52）。结果计算结果计算根据所测样品提取液的光吸收值，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（ug）。SODSOD 活力测定活力测定16邻苯三酚自氧化率的测定（邻苯三酚自氧化率的测定（Trace P
11、yrogallol methodTrace Pyrogallol method）取 ml 50 mmol/LTrisHCl，然后加入 25预热过的邻苯三酚溶液10ul，迅速摇匀，倒入光径 1 cm 的比色杯内，用 10 nmol/LHCl 作空白，325 nm 波长下每隔 30 s 测光吸收值一次，整个操作在 4 min 内完成，计算出每分钟A325 的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。要求自氧化速率控制在 0.070（OD 值）/min 左右。酶活力测定酶活力测定操作与上面基本一致，加入邻苯三酚前，先加入SOD 样液 10ul，测其光吸收值控制其自氧化速率在 35%65%，计算加酶后邻苯三酚自氧
12、化率。酶活性单位的计算酶活性单位的计算根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性：SOD 活力（U/ml）=MA0-AM100%V总A050%V定义V样式中，A0：为邻苯三酚自氧化率：AM：加酶后邻苯三酚自氧化率；V总：反应总体积；V样：加入样品液的体积；V定义：活性单位定义体积1 ml；M：样品稀释倍数。样品 SOD 比活力(U/mg)=单位体积活力(U/ml)/C式中，C：每 ml 样品液蛋白质含量(mg)。SOD 总活性(U)=单位活性酶原液总体积。SODSOD 纯度鉴定纯度鉴定样品制备样品制备取一定体积酶液，按酶液：40%蔗糖=1:1（体积比）的比例配成样品液，备用。凝胶的制备凝胶的制
13、备表表 2 2胶制备加量表Polyacrylamide gel-like form increases试剂编号30%的 Acr/Bis 溶液/ml分离胶缓冲液/ml浓缩胶缓冲液/mlH2O/ml10%SDS/ul10%过硫酸铵(AP)/mlTEMED/ul分离胶1001005浓缩胶50505加样及电泳加样及电泳将电泳槽注满电极缓冲液，分别在各样品槽中加10 20ul 样品液。在上槽加入少量0.025%溴酚蓝溶液作指示剂，接通电源（样品侧为负极），调电压至 150v 电泳，待样品全部进胶后，调电压至 200 V，至示踪染料下行距胶底1cm 处停止电泳，取出玻璃板。显色与脱色显色与脱色轻轻揭去一块玻璃板，另一板上的凝胶胶面朝下，再启胶一角注水，使胶缓缓落入培养皿中。将电泳后的凝胶在染料中浸泡2h，再放在脱色液中脱色，观察结果，拍照绘制模式图。