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1、蛋蛋白白质质的的盐盐析析 SANY GROUP system office room【SANYUA16H-蛋蛋白白质质的的盐盐析析（验验证证型型）一、实验目的一、实验目的了解在工业化生产过程中使用（NH4）2SO4的情况，及（NH4）2SO4使用时的注意事项。二、实验原理二、实验原理用高浓度中性盐使蛋白质从溶液中沉淀出来的方法称盐析。常用的中性盐有（NH4）2SO4、NaCl等。高浓度中性盐能使蛋白质沉淀是因为它具有脱水性，能脱去蛋白质胶粒水膜，又有中和蛋白质胶粒外双电层电荷的作用。不同蛋白质盐析时所需盐浓度不同，故调节盐浓度，可适当地将蛋白质分开。如球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中沉淀，清蛋白在饱
2、和硫酸铵溶液中沉淀，用盐析法沉淀的蛋白质并未变性，用稀释的方法或透析的方法可使之复溶。三、器材与试剂三、器材与试剂1、发酵溶液2、10%的三氯醋酸溶液3、饱和（NH4）2SO4溶液4、（NH4）2SO4粉末四、实验步骤四、实验步骤（1）取发酵溶液 5ml，加饱和（NH4）2SO4溶液 1ml2ml3ml4ml5ml，混匀，静止数分钟，即有白色沉淀析出，应为何物？过滤至清，除去沉淀，滤液备用。取少量沉淀，加 H2O看是否复溶？（2）取滤液 0.5ml，加 10%的三氯醋酸数滴，有白色沉淀产生，应为何物？然后在721 分光光度计OD600下进行透光率的检测，检测时必须在倒入比色皿以后 10 秒内读
3、取（为什么？）。（在进行检测时应注意将 721 分光光度计调整到 OD600；在测量前应把机器预热半小时左右。在检测时应注意有效的检测范围是 T值 15%以上到 70%以下）。（3）另外，取滤液 2.5ml 于小烧杯中，加（NH4）2SO4粉末，随加随搅拌，直至（NH4）2SO4不能溶解为止，有白色沉淀产生，应为何物？然后过滤至清，除去沉淀，过滤备用。（4）将（1）-（3）做的滤液中加10%三氯醋酸数滴观察有无沉淀产生。找到没有沉淀的加饱和（NH4）2SO4溶液的点。然后在 721 分光光度计 OD600下进行透光率的检测。并且作出曲线。（5）对大量的发酵液进行处理，在滤液中加 10%三氯醋酸
4、数滴观察有无沉淀产生。（6）盐析曲线的制作方法：如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下：取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分离样品溶液，冷至 05，调至该蛋白质稳定的 pH 值，分 610 次分别加入不同量的硫酸铵，第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚开始出现沉淀时，记下所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起点。继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第二个级分，如此连续可得到 610 个级分，按照每次加入硫酸铵的量，查出相应的硫酸铵饱和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜
5、的 pH 缓冲液中，测定其蛋白质含量和酶活力。以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图，即可得到盐析曲线。五、盐析注意事项：五、盐析注意事项：1.1.盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，溶液pH值越接近蛋白的等电点，蛋白质越容易沉淀。2.2.盐析一般用的硫酸铵，容易吸潮，因而在使用前，一般先磨碎，平铺放入烤箱内60烘干后再称量，这样更准确。3.3.在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。4.4.盐析后最好搅拌40分钟到一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。为了避免盐对酶的
6、影响，一般脱盐处理后再测酶活性。5.5.盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，一般可用超滤或者G-25，G-50处理。6.6.一般粗提物蛋白完全沉淀是在硫酸铵浓度在70%左右。六、盐析影响因素：六、盐析影响因素：1 1蛋白质的浓度：中性盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实际浓度对分离的效果有较大的影响。通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。对低浓度的蛋白质，要使用更大的硫酸铵饱和度，但共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低。通常认为比较适中的蛋白质浓度是2.53.0，相当于25mg
7、/mL30mg/mL。2 2离子强度:各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。3 3盐的性质：最有效的盐是多电荷阴离子。4 4pHpH值：一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。5 5温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25）比0时溶解度低，更容易盐析。蛋白质沉淀后宜在4放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。盐析时，分子量较小的蛋白质逐步沉淀下来可能就值得怀疑。具体的蛋白需要具体的摸索，当然，对肽来说，结论也是一样的。七、思考问题七、思考问题1.用高浓度中性盐盐析蛋白质时的注意事项是什么？2.为什么在对对大量的发酵液进行处理时的效果没有小试是的效果好？