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1、DNA分子标记技术在动物遗传学中的运用,医学遗传学论文内容摘要：简单介绍了DNA分子标记技术, 阐述了DNA分子标记技术在水产动物遗传多样性分析、种质鉴定、亲缘关系研究、亲子鉴定、遗传图谱构建、QTL定位和分子标记辅助育种等方面的研究应用成果, 期望该技术在水产动物遗传育种研究中开拓新途径。 本文关键词语：DNA标记,动物遗传学,遗传,育种 品种是养殖业的物质基础, 培育高效、优质和抗病力强的品种是当下水产养殖业增产的有效途径。传统的新品种培育方式方法主要是选择育种, 利用选择育种的方式方法已经培育成很多水产动物新品种, 如荷包红鲤 (Cyprinus carpio var.Wuyuanens
2、is) 、彭泽鲫 (Carassius auratus var.Pengzesis) 、德国镜鲤 (Cyprinus carpio L.) 选育系等。传统育种方式方法在推动世界水产养殖业的发展方面发挥了非常重要的作用, 但超长的育种周期严重制约了育种业的快速发展。 近年来, 随着当代生物技术的不断发展, 细胞生物学、分子生物学等新兴生物技术开场被不断地运用到水产育种工作中, 为水产种业发展注入了新的活力。华而不实, 以新兴发展起来的DNA分子标记技术最引人瞩目, DNA分子标记的出现使基于此类标记的选择育种技术有了实现的可行性, 为水产动物的遗传育种研究开拓了新的途径, 显现出了宏大的应用潜力
3、。当下, DNA分子标记技术在水产动物遗传育种中的应用主要具体表现出在遗传多样性分析、种质鉴定、亲缘关系研究、亲子鉴定、遗传图谱构建、QTL定位和分子标记辅助育种等方面。 1 DNA分子标记技术 DNA分子标记技术是以基因组DNA的多态性为基础的一种新型遗传标记技术, 它能够直接反映生物个体在DNA水平上的差异。与传统的遗传标记相比, DNA分子标记具有标记位点多、遗传信息量大、实验重复性强、不受生物的年龄、发育阶段、性别和养殖环境条件的影响等特性, 因而倍受遗传学家和育种学家的青睐, 已被广泛地应用于生物的基因定位、基因克隆、遗传育种等众多方面, 并成为分子生物学与分子遗传学研究的主要内容之
4、一。如今, 应用于遗传育种领域的DNA分子标记技术主要有:随机扩增加态性DNA (Random amplified polymorphic DNA, RAPD) 、限制性片段长度多态性技术 (Restriction fragment length polymorphism, RFLP) 、扩增片段长度多态性 (Amplified fragment length polymorphism, AFLP) 、简单序列重复 (Simple Sequence Repeat, SSR) 、单核苷酸多态性 (Single nucleotide polymorphism, SNPs) 、表示出序列标签 (ex
5、pressed Sequence tags, ESTs) 、单链构象多态性 (single strand conformation polymorphism, SSCP) 、特异序列扩增 (sequence characterized amplified regions, SCAR) 、线粒体DNA (Mitochondrial DNA, mt DNA) 分子标记、可变串联重复序列 (Variable Number of Tandem Repeats, VNTR) 、核糖体DNA内转录间隔区 (internal transcribed spacers, ITS) 分子标记等。 2 DNA分子标
6、记技术在水产动物遗传育种中的应用 2.1 水产动物遗传多样性分析 遗传多样性是指种内或种间表如今个体、细胞、分子3个水平的遗传变异程度, 详细表如今形态特征、核型特征以及DNA分子水平的多态性。获得物种的遗传多样性和遗传构造信息不仅对物种的遗传变异与系统地位的研究具有重要意义, 而且能够为物种的分类和改进提供重要资料。分子标记是基于DNA差异进行个体或群体遗传多样性分析的有力工具。常用于水产动物遗传多样性分析的分子标记有RAPD、AFLP和SSR等。 孙景春等1利用40个随机引物对荷包红鲤、玻璃红鲤 (Cyprinus carpio var.Wananensis) 和兴国红鲤 (Cyprinu
7、s carpio var.Xingguonensis) 及野鲤 (俗称 江西三红 ) 进行了RAPD检测及聚类分析。结果表示清楚:三个品种内, 以荷包红鲤的遗传距离最小;对于品种间, 则是玻璃红鲤与兴国红鲤较为类似, 江西三红 之间的遗传差异较小。杨淞等2运用AFLP分子标记技术检测了橙色莫桑比克罗非鱼 (Oreochromis mossambicus) 和荷那龙罗非鱼 (Oreochromis hornorum) 的种群遗传多样性。2个罗非鱼种群均具有较高的遗传多样性, 橙色莫桑比克罗非鱼种群内遗传多样性相对更高层次些, 2种罗非鱼的种间遗传距离为0.279, 揣测该杂交组合可能具有杂种优势
8、。Mc Connel3对加拿大东海5个大西洋鲑 (Salmo salar) 群体的遗传多样性进行了微卫星分析。鲁双庆等4采用微卫星技术, 用9对微卫星引物对4个鲫鱼群体普通鲫鱼、红鲫 (C.auratus red var) 、白鲫 (C.auratus cuvieri) 和彭泽鲫 (C.auratus auratus var.Pengze) 的遗传多样性进行研究。结果表示清楚, 4个鲫鱼群体的遗传多样性总体水平较高, 但白鲫的遗传多样性最高, 鲫鱼的遗传多样性最低。 2.2 水产动物种质鉴定 种质鉴定在水产动物育种经过中具有非常重要的意义, 鉴定出优良遗传变异的个体能够明显地缩短育种年限, 进
9、而使育种工作得以高效的进行。水产动物种质鉴定方式方法有很多, 主要包括形态、养殖性能、染色体、同工酶和DNA分析等, 华而不实建立在DNA水平上的分子标记技术由于具有不受环境影响、数量丰富、遗传稳定等优点而在近年来得到广泛应用。常用于水产动物种质鉴定的分子标记主要有RAPD、SCAR、RFLP、SSR和Cytb等。 Govidaraju等5应用RAPD技术对7个石斑鱼 (Epinephelus drummondhayi) 群体进行了分析, 为石斑鱼的系统分类和种质鉴定提供了根据。邹曙明等6通过挑选获得了团头鲂 (Megalobrama amblycephala) 良种 浦江1号 3个特异的RA
10、PD扩增带, 将其转换成的SCAR标记Sc-1可作为检测团头鲂 浦江1号 良种的一个重要的分子遗传特征指标。Bematchez等7利用RFLP检测mt DNA多态性的方式方法鉴定了大西洋鲑的野生群体与养殖群体。Nielsen等8利用微卫星标记技术对5条丹麦河流中的大西洋鲑进行鉴定, 结果发现除引进种外, 这5条河流中仍有土着原种的分布。Barlett等9利用307 bp的Cytb基因序列数据成功地区分了加拿大东海岸4种有重要经济价值的金枪鱼大眼金枪鱼 (T.Obsus) 、蓝鳍金枪鱼 (Thunnus maccoyii) 、长鳍金枪鱼 (T.alalunga) 和黄鳍金枪鱼 (T.albaca
11、re) 。 2.3 水产动物亲缘关系研究 种群亲缘关系的研究在水产动物选育经过具有非常重要的意义, 它为确定育种方案、预测杂交优势提供了重要的理论根据。种群亲缘关系的传统研究方式方法是生化标记、细胞标记和形态标记, 但这些标记方式方法由于具有标记数目有限、多态性较差、易受环境条件影响等缺乏之处, 因而近年来已逐步被分子标记所取代。用于水产动物亲缘关系研究的分子标记主要有RAPD、RFLP、SNPs、mt DNA Cytb和D-loop等。 张四明等10利用RAPD技术对中华鲟 (A.sinensis) 、达氏鲟 (Acipenser dabryanus) 、史氏鲟 (A.schrenckii)
12、 、意大利鲟 (A.naccarii) 、短吻鲟 (A.brevirostrum) 、长江白鲟 (Psephurus gladius) 和匙吻鲟 (Polyodon spathula) 的基因组进行了研究, 说明了鲟形目鱼类的系统发育关系。Wilson等11利用mt DNA的RFLP分析了几种鲑科鱼类的系统进化关系, 得到的结果与经典的形态分析结果相一致。Smith等12利用10个SNPs位点成功地将分别位于美国和加拿大流域的大鳞大麻哈鱼 (Chinook salmon) 区分开来, 其精到准确度到达95%。江世贵等13用mt DNA扩增出细胞色素b (cytb) 基因, 研究了4种鲷科鱼类的
13、分类地位与进化关系。王伟等14对鳅鮀亚科2个属8个种10个个体D-loop全序列进行了测定, 讨论了鳅鮀鱼类的系统位置及属间互相关系。 2.4 水产动物亲子鉴定 亲子鉴定是根据亲代与子代的遗传特征来判定亲子关系的技术, 在水产动物中已得到广泛的应用。在水产动物家系选育中, 利用亲子鉴定技术能够准确地鉴定不同的家系, 这样就能够减少因分池饲养而产生的遗传差异, 同时也节省了空间, 降低了管理强度。另外在品种选育经过中, 亲子鉴定还能够有效的防止因近亲交配而导致的种质退化。水产动物亲子鉴定最常用的标记方式方法是微卫星标记。 孙昭宁等15利用微卫星标记确定中国对虾后代的亲缘关系, 以4个谱系清楚明晰
14、的家系为基础, 检测两对微卫星标记在中国对虾家系鉴别中的应用, 结果表示清楚, 利用两对微卫星引物产生的DNA指纹图谱, 能够有效地区分中国对虾4个家系。 Dean等16利用8个微卫星位点作为亲子鉴定分子标记, 对同池养殖的22个日本对虾家系后代10%的最优个体进行亲子鉴定, 从中挑选出生长较快及较慢的家系, 并检测了在商业养殖环境中性状表示出的基因环境互作效应。Jaime等17利用鲷科鱼类中发表的11个微卫星标记对金头鲷进行亲子鉴定, 来自于8个不同池塘中的159个亲本产下的996个个体分别被鉴定出来。葛会争等18采用8个微卫星标记对黑龙江野鲤 德国镜鲤 (正交组合) , 及德国镜鲤 黑龙江
15、野鲤 (反交组合) 进行亲子鉴定, 结果表示清楚, 正反交组分别利用6和8个多态性良好的引物就能正确鉴定。 2.5 水产动物遗传连锁图谱构建 遗传连锁图谱是基因组研究中一个特别必要的遗传工具, 其在水产动物中最重要的用处就是将单基因和多基因控制的性状进行定位, 然后克隆这些基因进行基因或标记辅助育种19,20。遗传连锁图谱的构建主要采用分子标记的方式方法, 用于水产动物遗传图谱构建的分子标记主要有RAPD、SSLP、AFLP、SSR和SNPs等。 孙效文等21利用RAPD技术与SSR技术建立了鲤鱼遗传连锁图谱。图谱中有RAPD标记56个、SSR标记91个、鲤鱼基因组大小5 789 c M左右,
16、 共建连锁组50个, 华而不实最大347 c M, 最小17 c M。Liu等22利用AFLP技术比拟了斑点叉尾鮰和蓝鲶 (I.furcatus) 的差异, 华而不实的53对引物产生的2 572个AFLP标记可用于鲶连锁图谱分析。日本学者Coimbra等23将微卫星标记和AFLP标记结合起来, 构建了牙鲆 (Paralichthys olivaceus) 的第1张遗传连锁图谱。Gilbey等24利用微卫星构建了大西洋鲑鱼连锁图, 连锁图中包含了15个连锁群和11个非连锁群, 华而不实15个连锁群存在50个微卫星标记。Stickney等25采用寡核苷酸微阵列技术, 构建了斑马鱼 (D.rerio
17、) 的第一幅SNPs遗传图谱, 该图谱由25个连锁群组成, 包括1 930个SNPs, 全长3 000 c M, 平均分辨率为6.98 c M。 2.6 水产动物QTL定位 水产动物大多数经济性状属于数量性状, 如生长速度、肉质、饲料转化率、抗逆性等, 数量性状在连锁图上的定位分析 (Quantitative Traits Loci, QTL) 是水产动物遗传育种研究的重要内容。当下, 用于水产动物QTL定位研究的分子标记主要是AFLP和SSR。 Nakayama等26利用AFLP技术和BSA在白化虹鳟 (Oncorhynchus mykiss) 中找到了4个与白化位点连锁的AFLP标记, 并
18、将其转化为微卫星标记, 利用此标记已将白化座位定位于虹鳟连锁图谱的G连锁群上。Sakamoto等27试图研究与虹鳟产卵时间有关的分子标记, 结果发现分布于7个连锁组中的13个微卫星标记与产卵时间有关。Robison等28从219个AFLP标记、2个微卫星标记和1个Alu I酶切多态标记共计222个标记中分别挑选出了与胚胎发育时间、胚胎长度、胚胎重量有关的分子标记。Ozaki等29利用121个微卫星标记分析鲑鳟鱼抵抗感染性胰坏死病毒 (Infectious pancreatic necrosis virus, IPNV) 的QTL, 发现华而不实的2个标记IPN R/S-1和IPN R/S-2与
19、IPN抗性显着相关。 2.7 水产动物分子标记辅助育种 育种是指采用一定的方式方法将育种材料中有用的遗传变异转移到新品种中的经过。传统的育种主要采用表现型选择的方式方法, 但这种方式方法在新品种的培育方面往往需要花费很长的时间。育种家在长期的育种实践中不断的尝试采用遗传标记来提高育种的选择效率与育种预见性。传统的遗传标记方式方法由于存在着一定的局限性, 因而难以知足遗传育种工作的需要。新近发展起来的分子标记辅助育种技术由于是直接通过分析相关分子标记的基因型来获得期望的个体, 因而能够大幅度提高育种的效率。当下, 用于水产动物分子标记辅助育种的分子标记主要有RAPD、AFLP和SSR等。 Elo
20、等30利用RAPD分子标记技术对大西洋鲑和褐鳟 (Salmo trutta) 进行了杂交实验的研究, 结果发现RAPD技术是一种非常有效的标记辅助育种手段。刘云国等31利用61对AFLP引物组合扫描了牙鲆 (Paralichthys olivaceus) 感病群体和抗病群体各20个个体, 扩增出3 200条带, 8条AFLP带在2个群体中显示了极大的差异, 华而不实2条带是在抗病群体中出现的高显性基因频率的标记, 另外6条带是在感病群体中出现的高显性基因频率的标记, 揣测这些标记很可能是与抗病性相关的候选标记, 这些候选标记的获得为实现牙鲆分子标记辅助育种和抗病基因克隆奠定了一定基础。鲁翠云等
21、32利用微卫星标记辅助进行镜鲤 (Cyprinus carpio L.) 家系的建立及选育, 通过对亲本遗传构造及遗传差异进行分析, 预测产生优良家系的最佳配组。用28个微卫星分子标记评估松浦镜鲤亲本群体的遗传潜力, 结果显示, 群体处于高度的遗传多样性水平, 具备进一步繁育挑选优良群体的潜质。 3 瞻望 DNA分子标记技术在近年来得到了飞速发展, 并被广泛应用于动植物的遗传育种研究。随着分子生物学及新兴的生物科学技术的快速发展, 越来越多的成本低廉、操作简单、信息量大的分子标记将被研发出来。同时, 这些分子标记技术也必将会在水产动物遗传图谱的构建、重要经济性状基因的分离与克隆、种质资源保卫与
22、利用以及优良品种的培育等方面得到广泛的应用。 以下为参考文献 1孙景春, 楼允东, 姚纪花.应用RAPD技术分析三种红鲤遗传多样性J.上海水产大学学报, 2001, 10 (3) :207-212 2杨淞, 叶星, 卢迈新, 等.橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼的AFLP分析J.中国海洋大学学报, 2006, 36 (6) :937-940 3McConnell S, Hamilton L, Morris D, et al.Isolation of Salmonid microsatellite loci and their application to the population genetics of Canadian east coast stocks of Altantic salmonJ.Aquaculture, 1995, 137:19-30