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1、hTERC基因在宫颈上皮癌变过程中的表达及诊断意义,医学检验论文 液基细胞学检查的广泛应用明显降低了宫颈癌的发病率，但其筛查敏感度较低，易出现假阴性结果1。HPV 感染是宫颈癌发病的首要因素，HPVDNA 检测也成为宫颈癌筛查的一种重要手段，但由于大多数 HPV 感染具有自限性，很少进展成高级别病变，因而 HPV 检测在宫颈癌筛查中特异度也偏低，易出现假阳性结果2。且上述筛查手段( 包括联合筛查) 仅把可能的宫颈病变找出来，对早期病变的进展及转归无法准确判定，故筛查结果并不是特别可靠的恶变潜能指标。因而，临床上迫切需要一种新的方式方法和指标以早期发现尚处于低度病变的高危患者。近年来研究发现，人
2、端粒酶 NA 基因( human telomerase NA component gene，hTEC) 的异常表示出是肿瘤发生的基础，hTEC 基因的异常扩增可以能是宫颈癌构成的早期事件3，4。本文通过FISH 技术分析了 hTEC 基因在宫颈上皮癌变经过中的表示出，评估 hTEC 基因检测的临床价值，为宫颈 CIN 的早发现、早诊断提供实验根据。 1 材料与方式方法 1. 1 材料 收集并挑选 2018-05 2020-05 间在本院专科就诊的 115 例宫颈活检组织标本，参照(病理学诊断标准5，分为正常组( 包括炎症者) 25例，CIN27 例，CIN26 例，CIN 18 例，宫颈癌(
3、鳞癌) 19 例; 患者年龄 18 64 岁，平均 37. 3 岁。所有标本均由 2 名高年资病理医师统一确定诊断。FISH 所用 GSP TEC / CSP3 探针由广州安必平医药科技有限公司提供。 1. 2 方式方法 1. 2. 1 组织制片 所有活检标本经 4% 中性甲醛固定 6 24 h，全自动组织脱水机处理，常规石蜡包埋，4 m 厚切片，65 下烤片过夜备用。 1. 2. 2 检测前预处理 65 烤片 5 min，室温下二甲苯 20 min 2; 100% 乙醇 5 min 1; 依次 100%、85% 、70% 乙醇各 1 次 3 min，去离子水 3 min。100 的沸水 20
4、 min，晾干。37 蛋白酶 K 工作液消化 8 20 min，镜下观察，消化适宜后，2 SSC 溶液中漂洗 5 min 2。依次 70%、85%、100% 乙醇脱水，各 3min，室温晾干。 1. 2. 3 FISH 检测 避光滴加 10 l 杂交液( 含探针) ，荧光原位杂交仪上变性及过夜杂交( 变性温度83 1 ，5 min; 杂交温度 42 ) 。次日移去盖玻片，放入 46 1 的2 SSC 溶液5 min 2。70%乙醇 3 min，暗处自然枯燥。滴加 10 l DAPI 复染剂，暗处 20放置 20 min 后，荧光显微镜下观察。 1. 3 结果断定 信号断定: GSP TEC 探
5、针的荧光信号为红色，CSP3 对照探针信号为绿色。正常细胞间期胞核中红、绿信号各 2 个，若单个胞核中红色信号 2 个，绿色信号 2 个，则该细胞为 TEC 基因扩增异常细胞。阈值建立: 参照文献6报道，取20 例正常宫颈标本，以上述方式方法行 FISH 实验，每例分析 100 个细胞，统计出现 TEC 基因扩增异常细胞数目的百分比。异常阈值 = 平均数 + 3 标准差。本研究 TEC 阈值 =7. 13%，故设 8% 为异常阈值，判定 TEC 基因扩增结果阳性。结果判读:每例样本随机计数 100 个细胞，若异常细胞数的百分比 阈值，为( + ) ; 若 阈值，为( ) ; 若等于阈值，则加大
6、观测细胞数。 1. 4 统计学分析 采用 SPSS13. 0 统计学软件分别进行 2检验、Fisher 确切概率法、Spearman 等级相关分析及方差分析，绘制 OC 曲线，计算 OC 曲线下面积; 以病理为最终诊断计算 hTEC 基因检测对辨别高级别宫颈病变( CIN) 的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值和诊断比值比。 2 结果 2. 1 hTEC 扩增率 115 例宫颈活检组织标本中，hTEC 基因在正常组、CIN、CIN、CIN及宫颈鳞状细胞癌组中的扩增率分别为 4%、22. 2%、73. 1% 、83. 3% 和 94. 8% ，hTEC 基因的扩增率随着病变程度的加重
7、而增高，各组间差异显着( P 0. 01) ，尤其当宫颈病变由低级别( CIN) 转变为高级别甚或癌时( CIN) ，hTEC 基因的扩增率显着升高( 2= 13. 75，P 0. 01) 。同时，hTEC 基因的扩增率与病变的恶性程度呈正相关( r =0. 696，P 0. 01) ( 表 1) 。 2. 2 hTEC 基因阳性扩增的异常细胞数 hTEC基因扩增的异常细胞数在宫颈低级别病变( 正常和CIN) 时就可出现，但均处于较低水平，差异不显着( P 0. 05) ; 而当病变由低级别转变为高级别( CIN) 时，异常细胞数则显着提高( F = 25. 42，P 0. 01) ，且稳定在
8、较高水平( CIN 癌组间无差异，P 0. 05) 。hTEC 基因扩增的异常细胞数与宫颈病变的恶性程度呈明显正相关 ( r = 0. 721，P 0. 01) ，同时，随着宫颈病变的加重，hTEC 基因多重比例扩增率( 红 绿之比为4 2、5 2、4 4、6 5者)具有升高趋势( 表 1，图 1 4) 。 2. 3 hTEC 基因检测对预测宫颈高级别病变的临床评价 在宫颈高、低级别病变各组中，hTEC 基因扩增率及异常细胞数无差异( P 0. 05) ，故将其各自合并成 2 组 ( 表 2) 。63 例高级别病变中hTEC 基因扩增 52 例，阳性率 82. 5% ; 52 例低级别病变中
9、hTEC 基因扩增 7 例，阳性率 13. 5%; 两者差异显着( P 0. 01) 。hTEC 基因检测宫颈高级别病变的敏感度为 82. 5%，特异度为 86. 5%，阳性预测值 88. 1%，阴 性 预 测 值 80. 4%，诊 断 准 确 度84. 4% ，阳性似然比 6. 1，阴性似然比 0. 2，诊断比值比 30. 5; 其 OC 曲线下面积达 0. 862( 图 5) 。 3 讨论 宫颈癌的有效筛查和早期诊断是降低其发生率和病死率的关键。高危型 HPV 感染和整合是公认的宫颈细胞癌变的致病因素，但需要宿主遗传因素的介入才能导致细胞的恶性转化6。研究表示清楚，宫颈上皮细胞瘤变经过中几
10、乎均伴有 3 号染色体长臂的扩增，华而不实最重要的就是编码人端粒酶主体构造的端粒酶 mNA 基因( hTEC) 。hTEC 基因的表示出上调可激活端粒酶活性而维持端粒长度，引起染色体异常，使细胞逃避凋亡，导致宫颈癌发生。 hTEC 基因的扩增可出如今宫颈病变早期，且扩增率与宫颈病变程度显着相关。Heselmeyer-Haddad 等7最早采用 FISH 方式方法研究宫颈细胞涂片中 hTEC 基因的表示出情况，发现正常、ASC、LSIL 标本中只要少数病例 hTEC 基因扩增，而在 CIN、组中 hTEC 基因的扩增比例分别达 63% 和76% ，且四倍体细胞数和 hTEC 基因扩增率随宫颈病变
11、的严重程度而增加。Andersson 等8研究也发现，hTEC 基因扩增率在正常组和 CIN、分别为 7%、24%、64% 和 91%，在宫颈癌组达 100%，hTEC 基因的阳性率随着病变的加重而增高，尤其是在 CIN和之间愈加明显。进一步的随访研究还发现3，有 hTEC 基因扩增的低级别上皮内瘤病病例 1 3 年进展为高级别者达 40. 7%，而自愈者则无1 例存在 hTEC 基因扩增; 并且33%细胞学正常而 hTEC 基因扩增者，在经过短暂的潜伏期后可进展为高级别病变; hTEC 基因扩增者恶性转化率达 52% 96%，hTEC 基因扩增对于判定 CIN/向 CIN进展的敏感性到达 1
12、00% ，特异性为70% 。由此可见，hTEC 基因同时也是一个可靠的预测宫颈病变进展的生物学因子。 本研究中，hTEC 基因在正常宫颈组织和 CIN、及宫颈鳞状细胞癌中的阳性扩增率分别为4% 、22. 2% 、73. 1% 、83. 3% 和 94. 8% ，随病变严重程度增加 hTEC 基因扩增率也增加，两者具有较明显的正相关关系，与上述研究结果一致; 并 且hTEC 基因的扩增在宫颈病变的早期尤其是 CIN中就可出现，且这种基因的改变伴随着从 CIN至CIN及宫颈鳞状细胞癌的全经过。可见，hTEC基因扩增与 CIN 的严重程度有关，可能是宫颈癌构成的早期事件。值得注意的是，在本研究中，当
13、病变由低级别病变( CIN) 进展为高级别时( CIN) ，hTEC 基因扩增率由 22. 2% 增高到 73. 1% ，异常细胞数也由 5. 8 6. 2 增高到 25. 9 18. 2，变化显着，提示 hTEC 基因的异常扩增在宫颈 CIN向 CIN进展经过中扮演着重要角色，可能与宫颈病变不可逆转的恶性转化密切相关，而这一特点有助于临床预测 CIN/的进展或转归，可以辅助常规病理对 CIN和 CIN的诊断与分级。本研究还显示，随着宫颈病变的加重，hTEC 基因多重比例扩增率有升高趋势，即 hTEC 基因和 3 号染色体同时发生了非整倍体扩增，提示细胞恶性度增加。这与文献报道一致9，10。因
14、而，通过检测 hTEC 基因扩增情况并分析 hTEC 基因扩增类型，有助于评估宫颈病变的严重程度，预测宫颈病变的恶性转化潜能1，8。 hTEC 基因作为诊断宫颈病变的生物遗传学指标，其鉴别宫颈低级别病变( CIN) 和高级别病变( CIN) 的敏感度和特异度一般在 63. 9% 90% 和 81. 9% 93. 3%10 12。近期的一项 Meta分析13显示，hTEC 基因诊断高级别病变的合并敏感度、特异度和诊断优势比分别为 0. 81、0. 83 和17. 4，其 OC 曲线下面积为 0. 891; 与常规筛查方式方法相比2，其敏感度高于液基细胞学检查( 53. 9%) ，而低于 HPV
15、检测( 91. 3%) ; 其特异度高于 HPV 检测( 39. 3%) ，但比液基细胞学检查低( 93. 3%) ; 其诊断准确度及 OC 曲线下面积略高于其他两者; 讲明 hTEC 基因单独用于筛查宫颈高级别病变有较高的诊断价值，但其筛查效率的优势并不明显。本研究中，采用石蜡标本进行 hTEC 基因 FISH 检测，结果显示，hTEC 基因扩增对辨别宫颈高级别病变的敏感度和特异度分别为 82. 5%和 86. 5%，诊断准确度为 84. 4%，诊断优势比 30. 5，OC 曲线下面积达 0. 862，与上述的研究结果基本一致。但 hTEC基因扩增对宫颈高级别病变的阳性预测值到达88. 1%
16、 ，讲明 hTEC 基因扩增的病例宫颈发生恶性转化率较高，这与 Heselmeyer-Haddad 等3在宫颈细胞学水平的研究结果一样。 hTEC 基因既是一个与宫颈病变程度密切相关的遗传标记物，又是一个较为可靠的预测恶变潜能的分子标记物，可作为宫颈病变早期筛查、检测病情、评估预后的辅助指标。但单独使用时辨别宫颈高级别病变没有能表现明显的优越性，加上其检测成本昂贵，需要特殊设备和专业人员，尚不合适在宫颈癌普查中广泛运用。由于石蜡标本 hTEC 基因FISH 检测稳定可靠，对 CIN病变的诊断敏感度和特异度等指标均 80%，对常规病理鉴别 CIN与 CIN有困难时或由于人为因素影响 CIN 级别
17、判定时，可起重要的辅助作用，可明确组织分级、减少漏诊误诊、避免临床治疗缺乏或过度治疗。同时，由于 hTEC 基因具有预测恶变风险作用，有助于及早发现尚处于低度病变的高危患者，有利于临床及时采取干涉措施，减少宫颈高级别病变的发生; 对临床常见的复发性低级别 CIN，hTEC 基因检测可为判定宫颈病变的进展或转归提供一种有力的根据。 在常规的临床实践中，选择性地联合使用hTEC 基因检测及细胞学检查和 HPV 检测这两项传统的宫颈癌筛查技术，将有助于提高对宫颈癌前病变的检出率，降低宫颈癌的发病率和死亡率。 以下为参考文献: 1 Brown AJ，Trimble CL New technologie
18、s for cervical cancerscreening J Best Pract es Clin Obstet Gynaecol，2020，26( 2) : 233 242 2 Jiang J，Wei LH，Li YL，et al Detection of TEC amplificationin cervical epithelial cells for the diagnosis of high-grade cervicallesions and invasive cancer: a multicenter study in ChinaJ JMol Diagn，2018，12( 6) : 808 817 3 Heselmeyer-Haddad K， Sommerfeld K， White NM， et alGenomic amplification of the human telomerase gene ( TEC) inpap smears predicts the development of cervical cancer J AmJ Pathol，2005，166( 4) ，1229 1238