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1、人体自身抗体检测技术综述,医学技术论文摘 要： 本身抗体对于本身免疫性疾病的诊断、鉴别诊断、疗效观察及预后判定具有重要意义。近年来, 随着抗体挑选新技术的应用, 更多种类的本身抗体被发现, 其应用范围除本身免疫性疾病外, 已扩展至神经系统疾病、肿瘤、消化、生殖及移植等领域。当前, 本身抗体检测仍存在试剂参比溯源、检测经过一致性、结果同质互认等问题。制订试剂溯源及标准化操作规范将会引导本身抗体检测向自动化、微量化、智能化、高敏感、高通量的方向发展, 以便更好地为临床服务。 本文关键词语： 本身抗体; 标准化操作; 挑选技术; 瞻望; Abstract： Autoantibodies are ve
2、ry important for autoimmune disease to diagnosis, differential diagnosis, curative effect and prognosis.Recent years, with the application of the new antibody screening technology, a growing many kinds of autoantibodies were discovered, and the scope of its application has been expanded to nervous s
3、ystem disease, tumor, digestive and reproductive and other fields besides autoimmune disease.At present, there are many problems in autoantibody detection, such as the reagent cannot be compared with the source, the detection process is inconsistent, and the results cannot be homogenized.The develop
4、ment of guidelines for the traceability and standardization of reagents will guide to the direction of automation, micromation, intelligence, high sensitivity and high throughput, in order to serve for clinic better. Keyword： autoantibody; standardized operations; screening technology; prospects; 本身
5、抗体是指针对本身组织、器官、细胞、细胞亚构造、体内蛋白分子、体内核酸等所有本身抗原的抗体总称, 其本质为机体B细胞分泌的免疫球蛋白1。本身抗体分为生理性本身抗体 (或称天然本身抗体) (NAbs) 和病理性本身抗体 (PABs) 。有研究显示, 生理性本身抗体是维持机体处于健康状态的重要物质, 多为IgM型, 介入机体正常新陈代谢, 减少体内细胞凋亡物质的堆积2。当机体免疫调节功能受损时, 体内本身抗体大量产生, 多为IgG型, 与本身抗原亲和力高, 构成的免疫复合物通过Fc R激活炎性介质 (细胞因子) 或补体系统, 导致本身免疫性疾病的发生, 这种具有致病损伤作用的本身抗体即为病理性本身抗
6、体, 即通常所称的本身抗体3。 1、 本身抗体的种类 本身抗体种类很多, 通常采用两种分类方式方法, 一种为以疾病为中心, 即相关本身抗体与该疾病有关, 该分类法对于临床医生本身抗体项目申请具有重要意义, 同时也有助于对该疾病与本身抗体的全面认识;另一种为以靶抗原为中心, 即其命名为抗靶抗原抗体, 这有助于对本身抗体性质的认识, 也有助于对本身抗体对靶向组织攻击造成机体损伤的理解。从理论上讲, 机体内存在多少种抗原, 就能产生多少种本身抗体, 因而, 本身抗体扑朔迷离, 种类可达成千上万种, 本身抗体的命名应尽量根据抗体所针对的抗原进行, 便于名称的统一。以靶抗原为中心的本身抗体分类见图1。
7、1.1、 常规本身抗体 随着本身免疫学科的发展及检验技术的逐步普及, 本身抗体已成为大多数医疗机构的常规检测项目, 包括抗核抗体 (ANA) , 抗核抗体谱包括抗DNA、抗组蛋白及抗可提取性核抗原 (ENA) 抗体谱等, 抗中性粒细胞胞浆抗体包括抗蛋白酶3抗体 (抗PR3) 、抗髓过氧化酶抗体 (抗MPO) 等, 抗磷脂抗体 (包括抗心磷脂抗体、抗 2糖蛋白I抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体等) , 类风湿关节炎抗体 (包括抗CCP抗体、类风湿因子、抗角蛋白抗体等) , 本身免疫肝病抗体 (包括抗平滑肌抗体、抗线粒体抗体、抗肝肾微粒体-1抗体等) , 肌炎相关抗体 (包括抗Mi-2、抗信号辨别颗粒抗体
8、、抗PM-Scl100等) , 糖尿病抗体 (包括谷氨酸脱羧酶抗体、胰岛素抗体和胰岛细胞抗体等) 。华而不实ANA与抗核抗体谱是临床开展最为普遍的两类项目。ANA泛指抗各种核及胞浆抗原成分的一大类抗体, 推荐采用以HEp-2细胞为底物的间接免疫荧光法进行检测。而抗核抗体谱是指针对明确纯化抗原抗体的集合, 其与传统的ENA抗体谱有所不同, 传统ENA抗体谱检测通常采用磷酸盐缓冲液提取动物胸腺细胞核蛋白作为抗原底物4。但由于核成分中的DNA和组蛋白等碱性成分无法被磷酸盐缓冲液 (pH=7.2) 提取, 因而, 传统ENA抗体谱并未包括抗DNA抗体和组蛋白抗体等碱性靶抗原的抗体。 随着蛋白重组技术的
9、进步, 几乎所有蛋白分子均可重组合成, 当前临床上很少采用传统Western-blot法进行ENA抗体谱的检测, 从理论上讲, 合成纯化抗原检测结果准确可信, 且抗核抗体谱的检测范围远大于ENA抗体谱的范围。ENA抗体谱概念不再被使用, 因而, 采用大量重组蛋白的抗核抗体谱检测试剂盒在临床上已趋普及, 并被广大学者所接受。ANA荧光图型与抗核抗体谱靶抗原对应关系见图2。 图1 以靶抗原为中心的本身抗体命名分类图 1.2 、新型本身抗体 随着蛋白重组及本身抗体挑选技术的发展, 大量新型本身抗体集中涌现, 华而不实主要包括传统本身免疫疾病发现的一些本身抗体, 另外在其他领域如神经系统疾病、肿瘤、生
10、殖、消化系统疾病等也出现了一些新型本身抗体, 为其应用拓展了范围。肿瘤患者本身抗体反响通常与肿瘤组织或血清中的肿瘤相关抗原 (TAA) 的异常或过度表示出相关, 大部分的肿瘤本身抗体都是由TAA诱导产生的, 为肿瘤的诊断和鉴别诊断提供了新的实验根据。近年来出现的新型本身抗体见表1。 图2 ANA荧光图型与抗核抗体谱靶抗原对应关系 表1 近年来出现的新型本身抗体 2、 本身抗体挑选和发现 新型本身抗体的发现对于疾病诊断和认识具有重要意义。当前以HEp-2细胞为基质的ANA检测及以肝、肾组织为基质的ANCA和GBM检测已经在临床广泛开展21,22, 而临床实践经过中, 相当数量的医师和技师只关注熟
11、悉已经知道的荧光抗体模型, 对于特殊少见荧光模型很多情况下都主观以为是非特异性染色或杂质而忽略。实际上, 临床工作中碰到未知荧光抗体模型时应做具体记录, 并结合患者疾病或临床异常感觉和状态进行分析, 进而可能发现新的荧光模型与疾病之间的关系, 有利于新型本身抗体发现。 除此之外, 传统的Western-blot法也是发现新型本身抗体的检测方式方法。由于ENA抗原蛋白分离带非常多, 临床上会发现一些所谓的 杂带 , 这些杂带可能就是与疾病相关的新型本身抗体, 但临床实践中也常被忽略。当前, 由于该法检测ENA抗体谱的局限性, 以及检测结果的不确定性, Western-blot法检测ENA抗体谱已
12、很少使用, 取而代之采用纯化抗原的线性免疫印迹法、化学发光法或液相芯片技术进行检测。 虽讲上述两种方式方法具有发现新型本身抗体的可能性, 但荧光抗体检测基质及ENA提取物抗原种类有限, 基质并未包括人体所有的抗原物质, 这是发现新型本身抗体的内在缺陷。当前已发展出一些高效挑选本身抗体的方式方法。 2.1、 重组cDNA表示出文库的血清学分析 (SEREX) SEREX技术是本身抗体挑选的重要手段, 通过提取患者组织mRNA反转录成cDNA后导入噬菌体, 并溶原性感染大肠杆菌构建cDNA表示出文库, 将表示出产物转印在硝酸纤维膜上, 之后与患者血清反响, 然后对阳性克隆进行PCR测序鉴定即可得知
13、抗原种类, 同时也选出相应的本身抗体。 2.2、 噬菌体展示技术 噬菌体展示技术是将外源基因插入噬菌体衣壳蛋白基因, 使外源蛋白表示出在噬菌体外表, 大量表示出外源蛋白的单个噬菌体构成噬菌体文库, 展示的蛋白和血清中IgG本身抗体反响后, 挑选阳性噬菌体并扩增鉴定, 并采用测序方式确定本身抗原。 2.3、 蛋白芯片技术 首先, 纳入一定数量的研究患者及匹配的对照, 进而寻找患者与对照最为显着差异表示出的信号, 之后将选定的差异本身抗体在大范围患者确认, 以确定选定本身抗体诊断疾病的有效性。当前, 诸多学者已尝试采用约20 000个重组人蛋白的芯片, 系统性地发现免疫相关疾病及肿瘤的本身抗体23
14、。 3、 本身抗体检测新技术 二十世纪50年代中期至80年代后期的30余年间, 本身抗体的检测方式方法主要有间接免疫荧光法、放射免疫法、被动血凝法、颗粒凝集法、对流免疫电泳法、免疫双扩散法、放射免疫沉淀法、免疫印迹法等, 主要从细胞及蛋白多肽水平认识本身抗体。对于上述检测方式方法而言, 鉴于间接免疫荧光法检测结果的直观性、本身抗体检测的广泛性, 在今后一段时间内, 该方式方法仍将是不可替代的挑选检测方式方法。 上述本身抗体检测方式方法多为半定量的方式方法, 难以标准化, 使疾病诊断的特异度、灵敏度遭到限制。上世纪90年代后, 随着纯化靶抗原技术的进步, 试剂厂商采用纯化抗原制作试剂, 提高了本
15、身抗体的检测速度和准确性。本身抗体的检测主要朝2个方向发展, 即多个本身抗体同时检测的高精度、高通量检测方式方法的液相芯片技术 (又称多元流式点阵仪) 和单项本身抗体精到准确检测的化学发光法。两种检测方式方法均为高精度、全自动化大型检测仪器, 但其各有特点, 前者一次检测项目最多达100多项, 但其必须组合项目同时检测, 对于初诊患者而言, 确实能够通太多个疾病的本身抗体组合, 很快检测出相关疾病的本身抗体, 但其医疗成本较高, 对于确诊患者, 只需要检测单个或数个曾检测出的阳性本身抗体即可, 这对于液相芯片而言, 多项检测将造成资源浪费。随着医疗改革的推进, 居民医疗将按疾病种类进行保险支付
16、, 可促使医院及医生进行精到准确检测节约医疗成本。若液相芯片单个检测无法降低成本的情况下, 化学发光法将显示出其独特优势, 可单个项目检测, 且成本可控, 因而, 试剂仪器生产商将会对检测技术及检测成本进行竞争, 让临床能够得到更多、更好的选择。 4、 本身抗体检测标准及共鸣 标准或共鸣是专家对现在状况讨论分析后的操作建议。本身抗体检测共鸣的建立恰恰是由于本身抗体检测不规范、不统一、结果可比性差的现实背景下达成的一致意见。行业协会为提高检测质量及结果可比性做出了不懈努力。到当前为止, 主要有两类常规本身抗体 (ANA及ANCA) 制定了部分规范。 4.1、 ANA检测规范 2020年欧洲本身免
17、疫标准化促进会和本身抗体标准化委员会共同发表了(抗核抗体检测的国际建议。2020年8月在第12届本身抗体和本身免疫国际研讨会议上, 构成ANA荧光模型国际共鸣, 提出关于ANA荧光模型标准化分类命名的国际共鸣。中国医师协会风湿免疫科医师分会本身抗体检测专业委员会于2021年在中华检验医学杂志上发表了中国ANA检测共鸣24, 主要建议包括: (1) 推荐以HEp-2细胞为实验基质的IIF法是进行ANA检测的参考方式方法和首选方式方法; (2) 建议ANA检测时, HEp-2细胞在实验基质中每显微镜视野 (放大倍数为200倍) 应可见35个有丝分裂细胞; (3) 二抗应使用荧光素标记的抗人IgG抗
18、体; (4) IIF法检测ANA的稀释方式方法可根据不同的检测试剂而采用倍比稀释系统或根号10稀释系统; (5) 当临床高度疑诊时, 不管ANA总抗体的检测结果怎样, 都需要对针对靶抗原的特异性本身抗体进行检测; (6) 对ANA荧光模型做了相应要求, 必报荧光模型包括:均质型、斑点型, 细胞核致密斑点型、着丝点型、核点型、核仁型、胞浆颗粒型、线粒体型、高尔基体型、棒环状型、核膜型, 肌动蛋白型。 4.2、 ANCA检测规范 近年来发表了ANCA检测共鸣25,26, 其主要意见如下: (1) 当患者表现为肾小球肾炎 (十分是快速进展的肾小球肾炎) 、有系统特征的皮肤型血管炎, 多个肺结节、上呼
19、吸道慢性毁坏性疾病、长期鼻窦炎或耳炎、声门下气管狭窄、多发性单神经炎或其他周围神经病变、眶后肿块、巩膜炎等需检测ANCA; (2) 检测抗MPO抗体、抗PR3抗体的高质量方式方法应作为ANCA的筛查实验; (3) 若抗MPO抗体、抗PR3抗体阴性, 但临床高度怀疑小血管炎时, 应推荐到有经历体验的实验室进行检测; (4) 抗MPO抗体、抗PR3抗体阴性时, 不能排除腺相关病毒 (AAV) ; (5) 抗MPO抗体、抗PR3抗体阳性有助于诊断AAV, 但不能仅凭此诊断。 5、 本身抗体检测的问题及发展方向 本身抗体检测结果在同质化和结果互认方面存在很大障碍, 原因主要有下面两个方面, 第一为试剂
20、溯源问题, 当前关于抗原试剂性能评价并无能够溯源参比的国际组织, 因而, 检测结果通常会出现抗体滴度强弱不等。当厂商试剂比照检测结果出现差异时, 无法确定哪家试剂检测准确度较高, 临床通常采用检测结果与临床疾病诊断符合率进行分析, 这虽讲是一种比拟好的评价方式方法, 但大多数本身免疫病的诊断标准多为多项指标综合判定, 患者疾病异质性大, 十分是要评价的本身抗体检测指标往往是辅助指标, 本身抗体在疾病预示价值方面存在缺陷, 该指标在增加灵敏度的同时必然会损失特异度, 因而给临床和实验室造成宏大困难, 这将是今后本身抗体检测面临的最大问题。第二为实验操作问题, 当前多数本身抗体检测仍以手工操作或半
21、自动仪器检测为主, 检测结果仍受检测方式方法、检验试剂、检验仪器及实验人员的经历体验性等众多因素影响, 十分是荧光抗体检测受人为因素影响更大, 包括荧光显微镜的质量、技术人员对图像的认识、荧光强度的感悟、视力的好坏等。当前已有医院开场采用电脑图像采集, 然后通过观察显示器上图像进行结果判读, 这也带来新的问题, 如各公司图像采集卡的质量和参数不同, 显示器分辨率及显卡质量等存在很大差异, 同一图像在不同条件下能够得出完全不同的结果, 这一点值得实验室工作人员注意。 不久的将来, 本身抗体检测将迎来短期粗犷的发展和长期规范的调整。随着本身抗体挑选新技术的广泛应用, 将挑选出与各系统疾病有关的新型
22、本身抗体, 对于疾病诊断、鉴别诊断及发病机制的研究将提供重要的实验根据。除此之外, 为了更好地将本身抗体检测结果应用于临床, 并到达结果互认, 建议国际国内行业协会等部门牵头制订试剂溯源及标准化操作规范, 从顶层设计或行业强迫标准的高度规范本身抗体检验的试剂生产商、检测实验室及临床医生应用行为。从发展的角度而言, 本身抗体检测最终将实现全自动化、高通量、标准化和人工智能, 进而显着提高本身抗体检测质量, 实现不同实验室结果互认, 提高实验室临床服务能力。 以下为参考文献 1 RIGON A, INFANTINO M, MERONE M, et al.The inter-observer rea
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