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1、研究缺氧及诱导因子HIF-1对乳腺癌细胞生物学行为的影响,肿瘤学论文既往研究发现缺氧与肿瘤进展之间存在相关性。在缺氧条件下，肿瘤细胞产生了适应性的代谢改变；并且肿瘤细胞缺氧和放疗抵抗之间存在直接关联。细胞应对缺氧会产生一系列基因表示出的变化，缺氧诱导因子，在这一经过中起关键的作用。由 个亚基构成，具有氧不稳定性的 亚基存在 种亚型： 、 和 和稳定的 亚基也称为 ，芳烃受体核转位分子，毁坏 亚基和 亚基会引发小鼠胚胎心血管发育异常，导致胚胎的死亡。肿瘤细胞的高速增殖和肿瘤血管生成的异常，造成了实体肿瘤中的缺氧状态，实体肿瘤中常发现高水平的 亚基的蓄积。在肾癌、大肠癌的基因突变中，观察到了 亚基
2、的异常激活。近年的研究揭示了受 调节的基因作用于肿瘤发生发展的一些关键环节，例如肿瘤的增殖、血管生成、凋亡和自噬，细胞的侵袭和迁移等。更重要的是：临床研究发现 表示出的增加与多种癌症的不良预后直接相关。翟晓辉等学者也注意到了缺氧可能在乳腺癌中具有重要意义。本研究以人乳腺癌细胞系为研究对象，研究缺氧及缺氧诱导因子 对乳腺癌细胞生物学行为的影响，并进一步讨论其作用机制。 材料与方式方法 材料与试剂 细胞系：人乳腺癌细胞系 购自中国科学院细胞库。 主要试剂：重组慢病毒载体 及 合成购自上海吉玛制药技术有限公司，滴度均为 ；鼠单克隆抗人缺氧诱导因子 ，美国；鼠单克隆抗人广谱细胞角蛋白，美国；兔多克隆抗
3、人 平滑肌动蛋白 ，美国； 和 驴抗兔 和驴抗鼠 荧光二抗，美国；去铁胺试剂，美国；试剂，美国；基质胶，美国。 仪器与设备 小室，美国；共聚焦显微镜专用细胞皿，美国；多通道共焦激光扫描显微镜，德国；倒置荧光生物显微镜 数码照相系统，日本；激光扫描图像分析系统，美国；酶标仪，瑞士；蛋白与核酸电泳转印装置，美国。 方式方法 诱导细胞缺氧 低氧诱导缺氧：待细胞生长至 融合时，将细胞培养液换成新鲜培养液，置于小型培养箱中，灌入定制的 、和 混合气体，放入 培养箱中培养实验所需的时间；化学药品诱导缺氧：待细胞生长至 融合时给予超纯水配制的 的铁离子螯合剂去铁胺储存液，处理，调整 浓度为 ，鉴于去铁胺半衰
4、期短，对处理组施行天天半量换液并参加相应的药量，放入 培养箱中、培养实验所需的时间；正常条件培养的细胞放置于培养箱中、培养实验所需的时间。 慢病毒转染 根据慢病毒试剂盒的操作手册，对人乳腺癌细胞系 感染 及阴性对照，获得 正常表示出的细胞系 及 表示出受干扰的细胞系 。 详细步骤如下：将细胞接种于 孔板中，感染前细胞换液，每孔细胞参加 含 聚凝胺的新鲜培养基。病毒操作台中用 新鲜培养基液分别稀释 及 。参加病毒原液体积 为细胞 值经预实验确定为 病毒滴度每孔细胞数。稀释后的病毒液参加各孔。病毒转染专用培养箱中培养 小时后，换液继续培养 小时。天后，进行荧光计数法检测转染效率。 实验 转染 和阴
5、性对照小时后的细胞系分别正常、缺氧培养 小时后，收集细胞，提取蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。取 总蛋白上样，经 凝胶电泳分离蛋白后将蛋白电转移到硝酸纤维素膜膜上，封闭 小时，参加一抗 过夜。辣根过氧化酶标记的二抗室温作用 小时。液洗涤，待 膜稍干后，滴加适量的 显色剂显影并上机扫描测灰度值。每组实验至少重复 次。 共聚焦荧光染色 细胞接种于共聚焦专用培养皿中，密度 左右，给予诱导因素。各组细胞 多聚甲醛固定，封闭 小时，透膜处理。洗涤，参加一抗过夜。洗涤，参加荧光二抗，室温，避光，小时， 浓度 ； 浓度 。洗涤，参加 ，室温，避光，分钟，洗涤后上机检测。 法测定细胞增殖能力 调整实验组、阴性
6、对照组、空白对照组细胞密度为 个，根据每孔 接种于 孔板，每组设 个复孔，置于细胞培养箱中缺氧或者常规培养，分别在第、小时后进行 检测。每孔参加溶液 ，继续于 孵育 小时。吸出孔内培养液后，参加 液微升孔，将培养板置于微孔板振荡器上振荡 分钟，使结晶物溶解。在酶标仪上测定各孔的 值，以不加任何细胞的空白对照孔调零。实验重复 次。以时间为横坐标，个复孔的平均光吸收值为纵坐标，绘制生长曲线。 实验测定细胞侵袭能力 种入细胞前 小时以 的比例配置 胶，每孔 铺 小室，过夜凝固。取转染后 小时的细胞，无血清培养基调整各组细胞密度为 ，根据每孔 接种于小室上室。下室参加 含 血清的培养基，每组设 个复孔
7、，置于细胞培养箱中缺氧或者常规培养，在第 小时终止侵袭。用 多聚甲醛固定 分钟，棉签小心擦拭上室细胞及基质胶，用结晶紫染液染色 分钟。在倒置显微镜下观察，随机选取 个镜下视野 采集图片，计数各视野内细胞数量，取平均值绘制柱形图。 统计分析应用 统计软件对数据进行统计分析，对 组间正常培养、低氧培养和化学诱导缺氧数据的差异进行检验，有统计学差异。 结果 慢病毒转染 慢病毒感染细胞天后应用 荧光计数法检测 转染效率大于 。方式方法检测感染 小时后的细胞系在诱导缺氧小时后 的表示出，见图。慢病毒转染 后得到的细胞系 无论在低氧培养中还是化学药物诱导缺氧后， 的表示出都遭到抑制。而对照组 细胞系在低氧
8、培养和化学诱导缺氧后表示出 。 缺氧对乳腺癌细胞生长、侵袭能力的影响分析缺氧对乳腺癌细胞系生物学行为的影响：利用 实验检测细胞的增殖能力。无论是低氧培养还是化学刺激模拟缺氧，相较正常培养的细胞系，增殖能力在缺氧诱导 小时后开场明显减弱，其吸光值的差异不同具有统计学意义，而缺氧对 表示出受抑制的增殖能力无明显影响。根据吸光值绘制生长曲线，见图 。利用 实验检测细胞的侵袭能力。计数细胞，绘制表格后进行统计学分析，见图 。两组细胞系的实验结果显示：诱导缺氧 小时后正常表示出 的的侵袭能力明显加强，表现为通过上室的细胞数显着增加，其差异不同具有统计学意义，缺氧对 表示出受抑制的 侵袭能力无明显影响。
9、缺氧可诱导乳腺癌细胞发生上皮 间质转化，低氧培养及化学药物去铁胺诱导缺氧 小时以后，正常表示出 的 可发生 ，下调上皮标志物、上调间质标志物；而 表示出受抑制的 MCF无明显 改变。共聚焦荧光染色显示：在低氧培养和化学药物去铁胺的作用下，细胞极性发生变化，呈长梭形改变，上皮标志物人广谱细胞角蛋白，表示出下调红色荧光，间质标志物人 平滑肌动蛋白 表示出上调绿色荧光；无明显 变化，见图 。 讨论 本研究对低氧培养和化学药物诱导缺氧状态下，体外培养的乳腺癌细胞系 的增殖能力、侵袭能力作了系统的研究。研究发现：无论是低氧培养还是化学药物诱导的缺氧状态对乳腺癌细胞的生长有明显的影响。在缺氧培养组中，乳腺
10、癌细胞的增殖速度较正常培养的细胞明显降低，而通过慢病毒转染 干扰 的表示出后，缺氧情况下的细胞与未缺氧的对照组细胞相比，其细胞增殖速度则无明显改变，这讲明 的表示出对缺氧状态下乳腺癌细胞的增殖能力有重要的调控作用。在缺氧对乳腺癌细胞侵袭能力影响的研究中，我们得到了类似的结果：在缺氧培养组中，乳腺癌细胞的侵袭能力明显加强，而干扰 的表示出后，缺氧的细胞与未缺氧的对照组细胞相比，其侵袭能力无明显改变，这讲明了 的表示出对缺氧状态下乳腺癌细胞的侵袭能力有重要的调控作用。综合上述结果，缺氧可对乳腺癌细胞的生物学行为产生重要影响。尤其是增加了乳腺癌细胞迁移、侵袭的能力，这一影响是通过 这一亚基的正常作用
11、来实现的。干扰 的表示出，则缺氧对乳腺癌细胞生长、迁移、侵袭能力的影响消失。 当前研究发现上皮 间质转化，在肿瘤的侵袭和转移中起到非常关键的作用，在这一经过中，细胞失去了上皮细胞间的连接，获得了间皮细胞的特征和移动性，其耐药性、抗凋亡能力亦增加。缺氧和 能够影响 调节因子的表示出并促进转移的发生，研究显示：在肾癌中， 的表示出导致 钙粘素的缺失并增加转移；在头颈部鳞状上皮细胞癌中， 直接调节 重要的转录因子 ，增加肿瘤的侵袭和转移。在前列腺癌中。 通过 介导的方式，促进 的核蓄积。总之，肿瘤通过缺氧及缺氧诱导因子能够激活多个 相关基因，共同作用于侵袭、进入和移出血管、定植生长等肿瘤播散的各个阶
12、段。我们研究发现，乳腺癌细胞缺氧培养 小时后，正常表示出 的可发生 ，下调上皮标志物、上调间质标志物；干扰了 表示出的 则无明显 改变。通过共聚焦荧光实验得到验证：在缺氧和 作用下，细胞极性发生变化，呈长梭形改变，上皮标志物 表示出下调，间质标志物 表示出上调，证实细胞发生了 ；而 无明显 变化。以上实验讲明，缺氧引起 表示出上调，进而导致乳腺癌细胞侵袭移动能力加强是通过诱导细胞发生 来实现的。而 是怎样引起 的详细分子作用机制，还需要进一步基础研究来探明。 在体外条件下，诱导乳腺癌细胞系 缺氧能够降低细胞的增殖能力，增加其侵袭、移动能力。干扰 的表示出后，细胞系对缺氧的刺激无上述应答。缺氧能够诱导乳腺癌细胞 发生 ；而干扰 的表示出后，缺氧无法诱导细胞发生 。讲明缺氧对乳腺癌细胞系 生物学行为的影响是通过 介导来实现的。 【以下为参考文献】. ，： ，： ，： ，： ，： ，： ，： ：，： ，： ，： 翟晓辉，郭佑民乳腺癌的乏氧研究进展当代肿瘤医学，：