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1、异种移植中调节性免疫细胞的应用研究综述,免疫学论文摘 要： 异种移植是将来解决器官短缺最有前景的方式方法。近年来基因编辑和免疫学技术的进步推动了异种移植的快速发展,但是异种移植的临床应用仍然存在众多难以克制的障碍，华而不实排挤反响是引起异种移植失败的最重要原因。调节性免疫细胞是机体内一群具有负性调节功能的免疫细胞，能够抑制同种异体移植排挤反响，延长移植物的存活时间。本文总结了最近几年调节性免疫细胞在异种移植应用的研究进展，为异种移植排挤反响预防和治疗提供参考。 本文关键词语： 调节性免疫细胞; 异种移植; 排挤反响; 移植免疫; 调节性T细胞(Treg); 调节性树突状细胞(DCreg); 滤
2、泡调节性T细胞(Tfr); 调节性B细胞(Breg); Abstract： Xenotransplantation is the most promising method to resolve the organ shortage problem in the future. In recent years, the advances in gene editing and immunological technique have driven the rapid development of xenotransplantation. However, there are still man
3、y insurmountable obstacles in the clinical application of xenotransplantation, among which the rejection is the most important cause of the xenotransplantation failure. Regulatory immunological cells are a group of immunological cells with the negative regulation function in the body, which can inhi
4、bit allotransplantation rejection and prolong the survival time of the graft. This paper summarized the research progress of regulatory immunological cells in the xenotransplantation application in recent years, providing reference for the prevention and treatment of xenotransplantation rejection. K
5、eyword： Regulatory immunological cell; Xenotransplantation; Rejection; Transplantation immunity; Regulatory T cell(Treg); Regulatory dendritic cell(DCreg); Follicular regulatory T cell(Tfr); Regulatory B cell(Breg); 异种移植是指不同种类动物器官组织或细胞进行移植或移植给人类，是将来解决器官短缺最有前景的方式方法。近年来基因编辑和免疫学技术的进步推动了异种移植的快速发展，越来越多的学
6、者从事该领域研究。但是异种移植的临床应用仍然存在众多难以克制的障碍，华而不实排挤反响是引起异种移植失败的最重要原因。相对于同种异体移植，异种排挤反响更剧烈更难克制，机制也更复杂。当前临床常用的治疗手段很难到达令人满意的效果，且可引起患者出现免疫力极度低下和病原体感染等严重并发症1。调节性免疫细胞是机体内一群具有负性调节功能的免疫细胞，大量临床和基础研究证实调节性免疫细胞能够抑制同种异体移植排挤反响，延长移植物的存活时间2。本文总结了最近几年调节性免疫细胞在异种移植应用的研究进展，为异种移植排挤反响的预防和治疗提供参考。 1、 异种移植历史回首 1964年Reemtsma等3初次报道了黑猩猩供肾
7、给人类的异种移植。之后Starzl等4施行了狒狒作为供者的6例肾脏移植和2例肝脏移植。然而这些早期异种移植的受者或移植物存活时间均未超过1年，导致异种移植的临床与基础研究进入了低谷。上世纪80年代后，同种异体移植器官严重短缺引起了移植学家对异种移植的再次关注。1994年，Starzl等5报道2例狒狒供体的肝脏移植。1995年Makowa等6报道了1例猪供肝脏移植，以暂时性移植肝支持爆发性肝衰竭患者的肝功能。 基因编辑和免疫学技术的快速发展，使得近十多年异种移植获得了飞速的进展。Mcgregor等7将转人CD55基因猪的心脏移植给狒狒，同时应用高强度的免疫抑制方案，并输注可溶性Gal抗原以去除体
8、内天然抗体，移植物中位存活时间到达76 d，但同时受体也出现了一系列由过度免疫抑制而引起的感染并发症。Mohiuddin等8利用CD40抗体，将敲除 -1,3-半乳糖 -1,3-Gal基因和过表示出两种人体蛋白基因的猪心脏移植到狒狒体内，结果显示平均存活时间为298 d，最长的1只已经存活了945 d。固然缺少临床研究数据，其他器官大动物异种移植均获得了较大进步，肾脏、肝脏和肺脏移植物的最长存活时间分别到达了310 d、29 d和7 d。猪胰岛可能是将来最早进入临床应用的异种移植器官组织，当前已经有数种异种胰岛产品正在进行临床实验，显示异种胰岛可显着减少患者胰岛素的使用量。 2 、异种移植排挤
9、反响 相对于同种异体器官移植，异种移植的排挤反响更为复杂更难克制，主要包括超急性排挤反响hyperacute rejection,HAR、急性血管性排挤反响acute vascular rejection,AVR、急性细胞性排挤反响acute cell rejection,ACR。早期研究证实种系关系较远动物之间的大器官移植均会立即遭到HAR的毁坏，以血管内血栓和血管间出血为主要特征。HAR常发生于非协调性异种移植后数分钟至数小时，机制是人体内预存的天然抗体与移植物血管内皮细胞表示出的 -1,3-Gal抗原结合后，引发补体级联反响，进而严重毁坏移植物。AVR以血管损害为主要特征，在AVR的早期
10、即可见到移植物血管内皮外表有弥漫性的受者IgM或时有IgG的沉积。抗供者抗体、组织复合因子和凝血调节因子是AVR启动中重要的因素。若移植物能安全度过前两种排挤反响，人体还将对移植物产生主要由T细胞介导的排挤反响即ACR。CD4+T细胞、抗原提呈细胞和自然杀伤natural killer,NK细胞等在ACR致病经过中发挥着重要的作用9。 3、 调节性免疫细胞网络 除了效应性免疫细胞，人体内还存在很多发挥负性调节功能的免疫细胞，包括调节性T细胞regulatory T cell,Treg、调节性树突状细胞regulatory dendritic cell,DCreg、滤泡调节性T细胞follicu
11、lar regulatory T cell,Tfr和调节性B细胞regulatory B cell,Breg等。我们把这些具有负性调节功能的免疫细胞及其互相之间的复杂联络称为 调节性免疫细胞网络 ，其在有效地启动免疫应答、调控应答的强度与平衡并适时终止的经过中，发挥精到准确的负性调节作用10。 近年来调节性免疫细胞在同种异体移植领域的基础研究和临床应用均获得了很多突破性进展。Treg是机体内最重要的调节性免疫细胞，在调控免疫应答和维持外周免疫耐受中发挥着关键作用。大量研究显示Treg可诱导同种异体肾脏、肝脏、心脏和肺脏免疫耐受，延长移植物的存活时间11。Breg和Tfr均与体液免疫严密相关，研
12、究发现这两种调节性免疫细胞能够早期诊断和预防同种异体移植后抗体介导的排挤反响antibody mediated rejection,AMR的发生12。调节性浆细胞regulatory plasma cell,Preg是最新发现的一种调节性免疫细胞，通过淋巴细胞活化基因-3分子lymphocyte activation gene-3,LAG-3和白细胞介素interleukin,IL)-10发挥抑制浆细胞和抗体生成的功能13。因而Breg、Tfr和Preg在预防和治疗HAR和AVR中可能具有潜在的应用价值。 4、 Treg与异种移植 Treg是临床应用效果最明确的调节性免疫细胞，具有免疫抑制能力
13、强、作用特异性高、可体外大量扩增等优点。Treg主要通过两种方式发挥生物学功能：一是直接作用，Treg高表示出的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4,CTLA-4，能特异性结合B7分子，诱导活化的效应性T细胞处于免疫无能状态，除此之外Treg外表表示出的人类白细胞抗原-G(human leucocyte antigen-G,HLA-G、程序性细胞死亡受体-1(programmed cell death protein-1,PD-1和糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体glucocorticoid-induced tu
14、mor necrosis factor receptor,GITR等能够通过直接细胞接触发挥免疫抑制功能；二是分泌方式，Treg可分泌IL-10、转化生长因子- transforming growth factor- ，TGF- 和颗粒酶A等，抑制T细胞增殖活化和炎症因子释放，对体液免疫也具有一定的抑制作用14。近年来，很多研究显示Treg可进一步分为不同亚型，不同亚型Treg具有不同的特异性外表标志物和生物学功能。CD150highTreg和IL-35-producing Treg具有很强的免疫调控功能，而Foxp3lowCD45RA-Treg不具有免疫抑制作用，且能分泌干扰素interfe
15、ron,IFN- 等炎症因子15,16。 Treg在异种移植中的应用是当前的研究热门。很多研究证实人或者啮齿类动物的Treg在体外可有效抑制T细胞介导的抗猪异种排挤反响。Wu等17研究发现猪-啮齿类动物胰岛细胞移植后，耐受组淋巴细胞分类中Treg比例显着升高，去除Treg会显着提高异种排挤反响的发生率。Yi等18构建猪-狒狒异种心脏移植模型，发现Treg数量降低与排挤反响的发生严密相关，而耐受受者体内Treg数量在移植早期即呈上升趋势。在猪-小鼠异种胰岛移植中，移植3 d后Treg治疗可显着延长移植物存活时间 100 d，而对照组仅存活35 d。也有研究显示Treg治疗能够通过诱导B细胞凋亡，
16、降低大鼠-小鼠异种心脏移植排挤反响的发生率19。然而在大动物异种移植实验中，Treg治疗效果并不理想。Shin等20进行了猪-恒河猴异种胰岛移植实验，移植后输注体外扩增的Treg到受者体内，结果显示停止免疫抑制剂使用后，异种胰岛还是那样会发生强烈的排挤反响，也未观测到存活时间明显延长。这可能存在几个方面的原因：1相对于免疫抑制剂，Treg作用更为平缓和温和，很难抑制住剧烈快速的异种排挤反响；2异种排挤反响的微环境会严重损伤移植Treg的功能，部分Treg甚至会转换为Foxp3lowCD45RA-Treg等促排挤反响亚型；3当前异种移植研究主要集中在HAR和AVR这两种体液免疫相关急性排挤反响，
17、而对T细胞介导的异种排挤反响机制了解很少。 5 、DCreg与异种移植 树突状细胞dendritic cell,DC分化成熟可分为4个阶段，因而根据成熟程度，DC可分为DC前体细胞、未成熟DC(immature DC,imDC、迁徙期DC和成熟DC(mature DC,m DC，这是当前最常用的分类方式方法。mDC是最重要的抗原提呈细胞，在异种排挤反响中发挥着重要作用，可引起强烈的受者T细胞活化反响。imDC可以被称为耐受性DC，细胞外表高表示出吲哚胺2,3-双加氧酶indoleamine2,3-dioxygenase,IDO和免疫球蛋白样转录子4(immunoglobulin-like tr
18、anscript 4,ILT4等，可抑制T细胞增殖活化、介导T细胞凋亡和自噬、诱导Treg增殖等，因而具有诱导异种移植物免疫耐受的功能21。除此之外，很多研究报道了一种DCreg，具有很强的免疫抑制功能。大量研究证实DCreg可显着延长同种异体移植物的存活时间，并诱导其免疫耐受22。Ezzelarab等23构建非人灵长类动物肾移植模型，在移植前1 d输注供者抗原冲击的DCreg，结果显示其能够显着延长移植物的平均存活时间，且未检测到供体特异性抗体。DCreg进入临床实验早期主要治疗本身免疫性疾病，结果显示DCreg输注对类风湿性关节炎、1型糖尿病和克罗恩病均具有一定的治疗效果，且安全性也得到了
19、很好的验证。对于同种异体移植，多项DCreg治疗的临床实验已经得到了批准，当前正在美国匹兹堡大学等机构施行24。 DCreg在异种移植的应用当前尚处于起步阶段。Tian等25在猪-小鼠胰岛异种移植前输注CTLA4-IgG4修饰imDC，结果显示其能够显着延长移植物的存活时间，增加脾脏中Treg数量。Madelon等26使用雷帕霉素rapamycin,Rapa或者IL-10诱导单核细胞向DC分化，发现Rapa-DC和IL-10-DC均能够抑制人抗猪NK细胞活化及IFN- 的产生，IL-10-DC还对人抗猪细胞毒性T淋巴细胞激活具有很强的调控作用。Li等27在培养基中参加特定抗炎分子，能够快速诱导
20、狒狒耐受型DC产生，这种DC高表示出IL-10和TGF- 1，可抑制猪效应性T细胞增殖和IFN- 的产生。DCreg在大动物异种移植的治疗效果当前尚不清楚，需要进一步实验验证。除此之外，imDC应用于异种移植存在一定的争议，在排挤反响或者缺血-再灌注微环境下，imDC可能会进一步分化为mDC，加重排挤反响或者至少没有显着免疫抑制功能，采用环孢素、他克莫司或者维生素D3等诱导imDC产生致耐受原特性可能具有一定的治疗效果。 6 、结束语 异种移植是人类多年来不懈探寻求索的领域，临床异种移植尚无成功的经历体验。近年来异种移植基础研究进展迅速，大动物异种移植物存活时间显着延长，猪内源性逆转录病毒感染
21、问题也得到了解决。排挤反响还是那样是导致异种移植失败的最主要原因，调节性免疫细胞治疗为这一问题解决带来了曙光。Treg和DCreg均能显着延长异种移植物存活时间，诱导免疫耐受。当前调节性免疫细胞治疗也存在很多问题，在大动物异种移植中的治疗效果也不甚理想。相信随着基因编辑、免疫学和外泌体技术的进一步发展，调节性免疫细胞在异种移植中的治疗效果将会知足临床需求。最后我们引用器官移植巨匠Sir Roy Calne的一句话：Clinical xenotransplantation is just around the corner,but it may be very long corner。 以下为参
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