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1、PCR原理原理:PCR（聚合酶链式反应）（聚合酶链式反应）:是一种用于放大扩增特定的是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技片段的分子生物学技术，术，它可看作是生物体外的特殊它可看作是生物体外的特殊DNA复制，复制，PCR的最大的最大特点，是能将微量的特点，是能将微量的DNA大幅增加。基于聚合酶制造的大幅增加。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。延伸温度之间很好地进行控制。实时定量实时定量PCR技术：技术：利用荧光信号的变化实时检测利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一
2、个循环扩扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板值和标准曲线的关系对起始模板进进行定量分析行定量分析PCR工作过程：PCR反反应液加入了各种液加入了各种类型的型的荧光光标记物物在在扩增增过程中程中,荧光信号随着光信号随着PCR产物物的增加而增的增加而增强所有的定量所有的定量PCR仪器都有：器都有：1、热循循环模模块 2、光路系、光路系统3、检测器器 三个三个组成部分成部分每个循每个循环结束后束后,定量定量PCR仪器通器通过光光学系学系统记录荧光信号的增加光信号的增加最后最后,定量定量PCR软件件计算出数据，用于算出数据，用于实验结果的分析果
3、的分析PCR仪器仪器BIO-RAD CFX96 ABI7500 QuantStudio3 line9620定量标准曲线（定量标准曲线（Quantitation-Standard Curve)相对定量标准曲线（相对定量标准曲线（Quantitation-Relative Standard Curve)定量定量CT比较法（比较法（Quantitation-Comparative Ct Ct）溶解曲线（溶解曲线（Melt Curve)基因分型（基因分型（Genotyping）定性实验（定性实验（Presence/Absence)实验类型实验类型:绝对定量绝对定量&相对定量：相对定量：绝对定量的目的是
4、测定目的基因在样本中的分子数目,即通常所说的拷贝数.相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例,而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数.绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品,必须做标准曲线.相对定量可以做标准曲线,也可以不做标准曲线.AB7500AB7500绝对定量绝对定量1、双击桌面图标、双击桌面图标 ，或从，或从 Start All Programs Applied Biosystems 7500 Software 7500 V2.0 开启开启软件。进入主界面后选择软件。进入主界面后选择 Advanced Setup 。2.默认进入默认进入 Setup 下的下的 E
5、xperiment Properties 界面界面 2.1 输入实验名称输入实验名称（Experiment Name）2.2 确认仪器型号确认仪器型号 2.3 在实验类型中，选择在实验类型中，选择 Quantitation-Standard Curve2.4 选择试剂种类选择试剂种类2.5 确认运行模式确认运行模式TaqMan探针法探针法（寡核苷酸探针）：5 端端 荧光荧光报告基团报告基团 与靶基因与靶基因特异性结合的序列特异性结合的序列 3 端端 淬灭淬灭基团基团 完整的探针：检测不到报告荧光完整的探针：检测不到报告荧光 切断的探针：检测到报告荧光切断的探针：检测到报告荧光 5-3外切酶活性
6、将探针酶切降解外切酶活性将探针酶切降解 水解探针，使报告基团和淬灭基团分离水解探针，使报告基团和淬灭基团分离淬淬灭基基团报告基告基团3.进入进入 Setup 下的下的 Plate Setup 界面，编辑基因（界面，编辑基因（Target）及样本（）及样本（Sample）3.1在在 界面中设置基因及样品，界面中设置基因及样品，添添加新的基因，并在加新的基因，并在Target name编辑基因名称，编辑基因名称，Reporter和和Quencher中选择所标记的荧光基团及淬灭基团；中选择所标记的荧光基团及淬灭基团；利用利用 添加新的样本，并编辑样品名称。添加新的样本，并编辑样品名称。3.2在在 界
7、面中进行样品板的排布分配界面中进行样品板的排布分配 S:标准曲线数据点，标准曲线数据点，U:未知样本，未知样本，N:阴性对照阴性对照 勾选基因勾选基因 勾选样本名称勾选样本名称3.3 设置标准曲线：利用鼠标单选或拖曳以选择反应孔（一设置标准曲线：利用鼠标单选或拖曳以选择反应孔（一般情况下，每个般情况下，每个 梯度设置三个副孔），而后勾选左侧的基因，梯度设置三个副孔），而后勾选左侧的基因，在在Task选项中选择选项中选择S，在在Quantity中输入拷贝数。按照相同中输入拷贝数。按照相同操作，完成标准曲线其他数据点的设操作，完成标准曲线其他数据点的设 置（建议置（建议5个梯度）。个梯度）。标准曲
8、线标准曲线:标准品标准品 目的：生成标准曲线，建立目的：生成标准曲线，建立Ct值与浓度之间的线值与浓度之间的线性关系性关系标准曲线的制备标准曲线的制备:至少至少5个点的个点的10倍标准曲线倍标准曲线 10倍连续梯度稀释方法：倍连续梯度稀释方法：1v原液原液(标准品标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品稀释缓冲液，得标准品iv1v 标准品标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品稀释缓冲液，得标准品v 不可由标准品不可由标准品i分别加不同体积的稀释缓冲液直接分别
9、加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品得到标准品ii、iii、iv、v4.在在 Setup 下的下的 Run Method 界面中，设定反应条件。界面中，设定反应条件。5、点击、点击 文件储存成文件储存成 Experiment Document Single Files（*.eds）格式，）格式，然后在然后在 按下按下 按钮，按钮，反应即开始进行。反应即开始进行。6、实验结束后，点击界面右上角的、实验结束后，点击界面右上角的 Analyze 按钮，软件将按钮，软件将会显示实验结果：会显示实验结果：7、查看标准曲线时，可通过更改、查看标准曲线时，可通过更改Plot Settings来改变标准来改变
10、标准曲线的显示方式。曲线的显示方式。Eff%代表扩增效率代表扩增效率(Eff%：90%110%）。）。R2值代表标准曲线的数据点与回归曲线的接近程值代表标准曲线的数据点与回归曲线的接近程度，度，0.998 8、对于、对于 SYBR Green SYBR Green 法实验，可以在法实验，可以在 Melt Curve Melt Curve 界面中界面中查看熔解曲线。查看熔解曲线。9 9、检测、检测 QC Summary QC Summary 结果，可以快速查看实验中是否有反结果，可以快速查看实验中是否有反应孔存在异常情应孔存在异常情 况。黄色三角形中的数字况。黄色三角形中的数字 1 1 代表代表
11、有一种异常情况，有一种异常情况，2 2 代表有两种异常情况，代表有两种异常情况，以次类以次类推。详细信息及解决方案可以在推。详细信息及解决方案可以在 Flag DetailsFlag Details查看。查看。1010、分析之后的结果，可以利用菜单中的、分析之后的结果，可以利用菜单中的 FileExport FileExport 功功能，导出能，导出 Excel Excel 格式的结果。或者格式的结果。或者 视图板视图板布局选中所需孔位右击布局选中所需孔位右击CopyCopy，粘贴。，粘贴。若想存储图片结果，可直接在图片上单击鼠标右键，选择若想存储图片结果，可直接在图片上单击鼠标右键，选择 S
12、ave asSave as，存成，存成 JPEG JPEG 格式的图片。格式的图片。四个阶段四个阶段 对数图对数图对数图对数图 线形图线形图线形图线形图基线、阈值线、基线、阈值线、Ct值值自动设置基线：自动设置基线：每个样品都设置独立的基线，如果背景信号过高，软每个样品都设置独立的基线，如果背景信号过高，软件可能会将背景信号误认为扩增信号，这时，基线的范围会件可能会将背景信号误认为扩增信号，这时，基线的范围会被设置的很小，因此自动设置基线失败，需要被设置的很小，因此自动设置基线失败，需要手动设置基线手动设置基线。点击点击 选择基线设置不正确的反应孔，取消选择基线设置不正确的反应孔，取消“Aut
13、o Threshold”和和“Auto Baseline”选项选项基线一般为基线一般为3-15个循环个循环手动设定阈值：手动设定阈值：点击点击 选择基线设置不正确的基因，取消选择基线设置不正确的基因，取消AutoThreshold点击点击日常实验中的注意事项日常实验中的注意事项实验室分区：样品处理区、定量实验室分区：样品处理区、定量PCRPCR反应制备区、扩增区反应制备区、扩增区移液器使用带滤芯的枪头移液器使用带滤芯的枪头先加阴性对照，后加样品，再由低浓度到高浓度标准品，先加阴性对照，后加样品，再由低浓度到高浓度标准品，最后加阳性对照最后加阳性对照反应后的反应后的PCRPCR管应当直接废弃，切不可在实验区域内开启管应当直接废弃，切不可在实验区域内开启PCRPCR管管/8/8联管联管/板上不可用记号笔标记板上不可用记号笔标记PCRPCR管管/8/8联管联管/板使用光学平盖或光学膜，不要裸手触摸板使用光学平盖或光学膜，不要裸手触摸盖或膜表面盖或膜表面PCRPCR管或管或8 8联管要对称放置联管要对称放置 谢谢！谢谢！