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1、高效液相色谱分析技术方法开发 上海市食品药品检验所陈桂良方法开发 方法开发过程是指为分析样品选择合适的方法条件。这建立在预先了解样品的性质、功能团的pKa或pKb值、溶质分子的极性和大小、紫外可见光谱性质、氧化还原行为、浓度范围、溶解度以及其它方面的基础之上。根据这些知识，就可以选择合适的色谱模式、相应色谱柱、流动相组分、流速、检测器选择、梯度或等度洗脱条件和其它条件。经初步试验，一旦方法建立，就可以进行优化工作。优化是非常必要的，可以使所用组分在尽可能短的时间内，或者在低检测限下实现最佳分离，优化后的条件可以达到检测要求或定量要求。建立高效液相色谱分析方法的一般步骤 通常在确定被分析的样品以
2、后，要建立一种高效液相色谱分析方法必须解决以下问题：根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方式。由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。分析物理化性质混合分析物的主要差异分子结构和特性方法开发前要确定的基本问题方法开发前要确定的基本问题1、分析物的物理、化学性质样品基质-决定前处理方法溶解性-决定正、反相方法酸碱性-确定色谱柱类型、流动相组成pKa-确定流动相的pH值化学结构、特征官能团、Etc.方法开发前要确定的基本问题方法开发前
3、要确定的基本问题2、混合分析物的主要差异疏水性差异-用疏水性选择性强的色谱柱极性差异-用具有极性选择性的色谱柱芳香性差异-用芳香选择性色谱柱混合差异-用多种选择型色谱柱分子量差异-GPC、GFC方法开发前要确定的基本问题方法开发前要确定的基本问题3、分子结构决定选用何种分析方法HPLC-UVHPLC-IRHPLC-MSHPLC-ELSDEtc.如何得到最理想的分析结果如何得到最理想的分析结果流动相流动相流动相流动相,被分析物被分析物被分析物被分析物,和固定相三者之间的作用影响峰保和固定相三者之间的作用影响峰保和固定相三者之间的作用影响峰保和固定相三者之间的作用影响峰保留时间和峰分离性留时间和峰
4、分离性留时间和峰分离性留时间和峰分离性.峰保留时间短一般峰型较好峰保留时间短一般峰型较好峰保留时间短一般峰型较好峰保留时间短一般峰型较好,但分但分但分但分离可能不理想离可能不理想离可能不理想离可能不理想.所以为了调节最理想的分析结果所以为了调节最理想的分析结果所以为了调节最理想的分析结果所以为了调节最理想的分析结果,可以可以可以可以改变下列的一项或数项条件改变下列的一项或数项条件改变下列的一项或数项条件改变下列的一项或数项条件:流动相流动相 固定相固定相 pH 温度温度如何选择适当的色谱柱如何选择适当的色谱柱理想的柱子理想的柱子可以适用于分析所有的化合物可以适用于分析所有的化合物永远不会坏永远
5、不会坏理想分离度理想分离度决定峰分离度的三个要素决定峰分离度的三个要素 峰保留时间峰保留时间 选择性选择性(出峰的顺序出峰的顺序)柱效柱效固定相的选择固定相的选择 疏水性的选择疏水性的选择 极性的选择极性的选择 苯基的选择苯基的选择固定相疏水性考虑的要素固定相疏水性考虑的要素 键合相的种类键合相的种类(C18,C8,Phenyl,etc)表面积表面积 键合相的键合率键合相的键合率色谱柱选择表颗粒直径及形状(球型及不规则型)柱长及柱内径表面积及孔径碳负荷及键合类型Luna C18(2)GinsengRootColumn:Luna5mC18/ODS(2)Dimensions:150 x4.6mmI
6、DElution Type:GradientEluent A:Acetonitrile/water(15:85)Eluent B:Acetonitrile/water(80:20)Flow Rate:1.5mL/minTemperature:25CDetection:UV-VisAbs.VariableWave.205nmApp ID 1125Luna C8(2)&C5 减少疏水性化合物的保留时间减少疏水性化合物的保留时间减少疏水性化合物的保留时间减少疏水性化合物的保留时间减少分析的时间减少分析的时间减少分析的时间减少分析的时间Synergi Max-RP 疏水性和疏水性和疏水性和疏水性和 C
7、18C18柱类似柱类似柱类似柱类似 为一支为一支为一支为一支C12C12柱柱柱柱提供比提供比提供比提供比C18C18柱更尖的柱峰柱更尖的柱峰柱更尖的柱峰柱更尖的柱峰,尤其是分析碱性化合尤其是分析碱性化合尤其是分析碱性化合尤其是分析碱性化合物物物物Synergi Max-RPBasicDrugsatNeutralpH疏水性的比较疏水性的比较C18 phasesC8 phase300 C18 phase极性选择性的考虑极性选择性的考虑首先考虑首先考虑 固定相的极性封尾固定相的极性封尾,封端基团封端基团 分析物的极性官能基分析物的极性官能基之间的作用之间的作用极性选择性极性选择性如何增加极性的选择性
8、如何增加极性的选择性 极性基团封端极性基团封端 极性基团镶嵌极性基团镶嵌 苯基苯基极性选择性极性选择性Columns:Luna5mC18(2)YMC-Pack5mProC18Synergi4mPolar-RP(Ether-linkedPhenyl)150 x4.6mmMobilephase:75:25Methanol:waterFlowrate:1mL/minComponents:1.Estrone2.Estradiol极性选择性极性选择性LunaC18(2)Synergi Polar-RPYMC-PackProC181+21+212Synergi Max-RP -C12Synergi Hyd
9、ro-RP -C18Synergi Fusion-RP C18Synergi Polar-RP PhenylSynergiSilica Advantage Balancing Efficiency&BackpressureSilica Advantage Balancing Efficiency&BackpressureLinearVelocity(mm/sec)PlateHeight(H)543FlowRate(mL/min)PressureDrop(Bar)higher efficiencieslower backpressuresSynergiSynergi Max-RP与与C18柱性能
10、类似的柱性能类似的C12柱柱Synergi Polar-RP 保留极性和苯基化合物保留极性和苯基化合物保留极性和苯基化合物保留极性和苯基化合物 100%100%水溶液稳定水溶液稳定水溶液稳定水溶液稳定 增加极性的选择性增加极性的选择性增加极性的选择性增加极性的选择性Synergi Hydro-RP 疏水性非常强疏水性非常强疏水性非常强疏水性非常强 极性封端极性封端极性封端极性封端100%100%水溶性稳定水溶性稳定水溶性稳定水溶性稳定 增进极性的选择性增进极性的选择性增进极性的选择性增进极性的选择性Synergi Hydro-RP VS.Luna C18(2)Synergi Hydro-RP
11、Synergi Hydro-RPSynergi Hydro-RPSynergi Max-RPSynergi Max-RPMobile Phase:A:20mM KH2PO4,pH 4.6B:AcetonitrileGradient:A/B(95:5)to A/B(65:35)in 15 minFlow rate:1.5 mL/minSample:1.Morphine2.Hydromorphone3.Codeine4.Nalorphine5.OxycodoneSynergi Hydro-RPSynergi Fusion-RP 增加极性的选择性同时减少疏水性的分析时间增加极性的选择性同时减少疏水性
12、的分析时间增加极性的选择性同时减少疏水性的分析时间增加极性的选择性同时减少疏水性的分析时间 在水溶液中在水溶液中在水溶液中在水溶液中100%100%稳定稳定稳定稳定min02468101214mAU0100200300400500VWD1A,Wavelength=210nm(S:HPCHEM1DATASW1003TEST0034.D)min02468101214mAU050100150200250300350VWD1A,Wavelength=210nm(S:HPCHEM1DATASW1003FUSI0046.D)Running ConditionsMobilephase:75:2520mMPo
13、tassiumphosphatepH2.5:AcetonitrileFlowrate:1.5ml/minTemperature:AmbientDetection:210nmInjection:1.Maleicacid2.Chlorpheniramine3.Triprolidine4.DiphenhydramineSynergiFusion-RP4 80一般的C18柱极性增大极性增大疏水性减少疏水性减少Synergi Fusion-RPAvg symm:0.91Synergi Max-RPAvg symm:0.77Luna C18(2)Avg symm:0.82 Running Conditio
14、nsMobilephase:A:25mMTrispH9B:ACNGradient:40%-70%Bin15minutesFlowrate:1.0ml/minDetection:230nmComponents:1.Scopolamine,LogP=2.Lidocaine,LogP=2.443.Noscapine,LogP=1.97苯基的选择性影响苯基的选择性影响 被分析物和固定相之间产生的被分析物和固定相之间产生的作用作用LunaPhenyl-Hexyl 使用甲醇可以增加使用甲醇可以增加作用效果作用效果Luna Phenyl-Hexyl 具有疏水性和苯基双重的选择性具有疏水性和苯基双重的选择性具
15、有疏水性和苯基双重的选择性具有疏水性和苯基双重的选择性 重复性高和稳定的苯基固定相重复性高和稳定的苯基固定相重复性高和稳定的苯基固定相重复性高和稳定的苯基固定相Luna Phenyl-HexylGreenTea(绿茶)Column:Luna5uPhenyl-HexylDimensions:250 x4.6mmMobile Phase A:0.2%AceticacidinWater/Acetonitrile(91:9)B:Water/Acetonitrile(20:80)Gradient:100%Atot=25min,(68:32)t=25mintot=35min,hold100%Bfor10m
16、in.Flow Rate:1ml/minTemperature:350CApp ID 14436苯基的影响苯基的影响Columns:Luna5mC18(2)150 x4.6mmLuna5mPhenyl-Hexyl150 x4.6mmSynergi4mPolar-RP150 x4.6mmMobilephase:50:50Acetonitrile:20mMPotassiumphosphatepH2.5Flowrate:1.0mL/minComponents:Acidic,aromaticcompounds1.Indoprofen2.Ethylparaben3.Naproxen4.Diflunisa
17、l5.Indomethacin6.IbuprofenC18(2)Phenyl-HexylPolar-RP苯基的影响苯基的影响pH的影响的影响当选择流动相的当选择流动相的pH时时,我们必需考虑我们必需考虑到到pH对分析物和柱子两者的影响对分析物和柱子两者的影响pH对柱子的影响对柱子的影响即使键合完美即使键合完美即使键合完美即使键合完美,封端完好封端完好封端完好封端完好,硅胶表面还是会存在硅胶表面还是会存在硅胶表面还是会存在硅胶表面还是会存在Si-O-HSi-O-H的微酸游离基的微酸游离基的微酸游离基的微酸游离基 pKa3.5pKa3.5如果流动相的如果流动相的如果流动相的如果流动相的pHpH是是
18、是是4 4以上以上以上以上,此此此此 Si-O-HSi-O-H的游离基会的游离基会的游离基会的游离基会脱氢脱氢脱氢脱氢,成为带负电的成为带负电的成为带负电的成为带负电的Si-O-(Si-O-(这会造成和分析物之这会造成和分析物之这会造成和分析物之这会造成和分析物之间的极性反应间的极性反应间的极性反应间的极性反应,而造成峰拖尾而造成峰拖尾而造成峰拖尾而造成峰拖尾)如果流动相的如果流动相的如果流动相的如果流动相的pHpH是是是是8(8(或或或或10)10)以上以上以上以上,硅胶会被破坏硅胶会被破坏硅胶会被破坏硅胶会被破坏,造造造造成柱子损害成柱子损害成柱子损害成柱子损害pH对分析物的影响对分析物的
19、影响基本上基本上,反相柱的峰保留时间长短反相柱的峰保留时间长短,主要主要归因于疏水性的非极性反应归因于疏水性的非极性反应.所以要增长所以要增长峰保留时间峰保留时间,必需选择流动相的必需选择流动相的pH能够能够让分析物保持中性让分析物保持中性对酸性分析物对酸性分析物(pKa3-6),基本选择基本选择pH在在 pKa以下以下对碱性分析物对碱性分析物(pKa9-11),基本选择基本选择pH在在 pKa以上以上对碱性分析物的分析建议对碱性分析物的分析建议多数硅胶柱没法于高多数硅胶柱没法于高pH条件下稳定条件下稳定,所以所以一般分析碱性化合物时一般分析碱性化合物时,会选择于会选择于pH1.5-3下进行分
20、析下进行分析.在此在此pH条件下条件下,硅胶表面的游硅胶表面的游离离Si-O-H会保持中性会保持中性,减少离子间的二极反减少离子间的二极反应应,因而减少峰拖尾因而减少峰拖尾,峰型较好峰型较好但是在低但是在低pH条件下条件下,碱性化合物的极性增碱性化合物的极性增加加,疏水性减少疏水性减少,如果要增加峰保留时间如果要增加峰保留时间,流流动相的有机溶剂比率必需减少动相的有机溶剂比率必需减少对碱性分析物的分析建议对碱性分析物的分析建议在高在高pH条件下条件下,碱性化合物可以保持中性碱性化合物可以保持中性,疏水性疏水性因而增加因而增加,但是如果峰保留时间太长但是如果峰保留时间太长,可以将流动可以将流动相
21、的有机溶剂比率增加相的有机溶剂比率增加,以缩短保留时间以缩短保留时间.增加选增加选择分析条件的弹性择分析条件的弹性流动相的有机溶剂比率增加流动相的有机溶剂比率增加,以缩短保留时间外以缩短保留时间外,并可以增进峰型并可以增进峰型(尖尖)但是问题是但是问题是:如何在高如何在高pH(8以上以上)条件下分析条件下分析?高高pH对碱性分析物的分析对碱性分析物的分析选择选择使用高分子柱使用高分子柱使用高分子柱使用高分子柱使用使用使用使用双子星柱双子星柱(GEMINI)Gemini C18 双子星柱双子星柱 在在在在pH 1-12pH 1-12范围内很稳定；范围内很稳定；范围内很稳定；范围内很稳定；适用于酸
22、适用于酸适用于酸适用于酸,中中中中,碱性化合物碱性化合物碱性化合物碱性化合物,特别是分析中碱性化合物特别是分析中碱性化合物特别是分析中碱性化合物特别是分析中碱性化合物很理想；很理想；很理想；很理想；可以更有弹性的调节可以更有弹性的调节可以更有弹性的调节可以更有弹性的调节pHpH以得到合适的分析条件。以得到合适的分析条件。以得到合适的分析条件。以得到合适的分析条件。Gemini C18流动相流动相pH的影响的影响pH 1 12 StabilityGemini C18pKapKa 硅胶纯度（金属含量）硅胶纯度（金属含量）Columns:A型硅胶 (=旧型号)B型硅胶(Gemini 5m C18)M
23、obile phase:10mM 甲酸铵 pH 3.5:乙腈:甲醇（35:15:50）Flow rate:1.0 mL/minComponents:1.Rhodamine 123 2.Rhodamine 6G3.Rhodamine B Base玫瑰精玫瑰精,若丹明若丹明(一种红色荧光染料一种红色荧光染料)色谱图A型硅胶C18化合物被吸收B型硅胶 （Gemini C18)峰形、峰高、分离正常金属的影响（1）金属的影响（2）流动相的选择有机相的选择缓冲液的选择离子对的选择程序洗脱其他流动相中有机相的选择*甲醇：洗脱能力较弱，压力较大；使用苯基柱时推荐使用。*乙腈：洗脱能力较强，压力较小；使用末端吸
24、收时和梯度洗脱时推荐使用。*梯度时：缓冲液pH值的选择酸性分析物：pHpKa-2单一碱性分析物：pH3.5 或pHpKa+2复杂碱性混合物：pHpKa+2 1.氯磺丙脲（pKa5.0)2.对羟基苯甲酸丁酯 3.利多卡因（pKa 7.9)4.苯丙烯啶（pKa6.5)5.右甲吗南(pKa 9.2)应用实例：苦参色谱柱：Gemini C18 5u 250 x4.6mm流动相：0.01M醋酸铵-乙腈（梯度）流动相常用溶剂的极性和截止波长 由极性可以看出，在反相色谱中，要使出峰时间加快，可增加流动相中的乙腈比例，但要注意分离度的减小；若要使出峰时间减慢，可增加流动相中水的比例，增加水的比例还会引起分离度
25、的增加；两者之间综合来考虑。举例说明。异丙醇转相时必须用；四氢呋喃使用时注意波长。必须选用色谱级的。由于甲醇的极限波长为210nm左右，故短波长测定时，最好不要采用甲醇，而用乙腈。样品稀释用溶剂的选择：测定有关物质时最好选用流动相，避免以溶剂峰的干扰，水往往出倒峰。含量测定时，溶剂依情况而定，有时选用流动相费用太高，或是不易于操作。进样量最好选用定量环的量，以避免由于进样不准而引起的偏差。定量环可进行更换。各溶剂截止波长各溶剂截止波长检测器和检测条件的选择检测器的选择检测条件的选择灵敏度问题检测器类型 最通用的紫外检测器：注意测定波长较短时，基线有可能会飘；洗柱子时，尽量关闭光源，以延长使用寿命。二极管阵列检测器：目前使用者越来越多。用于多波长检测、峰纯度测定、对被测定物质进行紫外扫描后选择波长等用途。荧光检测器：灵敏度更高，对那些g级的制剂品种，有时适用。但缺点是，基线稳定需平衡时间较长。示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器（电导检测器）等。举例说明HPLC法测定盐酸氟西汀的有关物质及其胶囊的含量HPLC法同时测定福辛普利钠片中福辛普利钠及其降解产物福辛普利拉的含量HPLC法用于苯唑西林钠及其制剂中含量和有关物质的测定