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1、菌种的保藏本讲稿第一页，共二十五页菌种保藏的意义菌种保藏的意义菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种.微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种保藏是一项重要的基础工作，是微生物学基础工作的一项重要内容，也是药品微生物工作中的一项常用技术。本讲稿第二页，共二十五页概念概念标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。标准储备菌株：由标准菌株经一次传代得到的培养物。商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株。工作菌
2、株：由标准储备菌株经传代得到的培养物。本讲稿第三页，共二十五页中国医学菌种保藏中心提供的标准菌株中国医学菌种保藏中心提供的标准菌株本讲稿第四页，共二十五页法国生物梅里埃公司提供的商业派生菌株法国生物梅里埃公司提供的商业派生菌株本讲稿第五页，共二十五页保藏的标准储备菌株保藏的标准储备菌株本讲稿第六页，共二十五页制备的工作菌株本讲稿第七页，共二十五页菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。菌种衰退不是突然发生的，而是从量变到质变的逐步演变过程。开始时，在群体细胞中仅有个别细胞发生自发突变（一般均为负变），不会使群体菌株性能发
3、生改变。经过连续传代，群体中的负变个体达到一定数量，发展成为优势群体，从而使整个群体表现为严重的衰退。本讲稿第八页，共二十五页菌种衰退的原因菌种衰退的原因1、菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。2、表型延迟现象也会造成菌种衰退。3、质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多，不少抗生素的合成是受质粒控制的。4、连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。5、不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。本讲稿第九页，共二十五页如何预防衰退如何预防衰退1、合理的育种2、选用合适的培养基3、创造良好的培养条件4、控制传代次数5、利用不同类型的细胞进行移种传代6、采用有效的菌种保藏方法本讲稿第
4、十页，共二十五页菌种的复壮菌种的复壮菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。本讲稿第十一页，共二十五页复壮的方法复壮的方法1、纯种分离。采用平板划线分离法、稀释平板法或涂布法均可。把仍保持原有典型优良性状的单细胞分离出来，经扩大培养恢复原菌株的典型优良性状，若能进行
5、性能测定则更好。还可用显微镜操纵器将生长良好的单细胞或单孢子分离出来，经培养恢复原菌株性状。2、通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillusthuringiensis的复壮）。主要是对一些寄生性的菌株，可以将衰退的菌株接种到相应的宿主体内，提高其寄生性能及其它性能。3、淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。可以采用各种外界不良理化条件,使发生衰退的个体死亡,从而留下群体中生长健壮的个体.4、4、采用有效的菌种保藏方法。本讲稿第十二页，共二十五页菌种保藏的基本原理菌种保藏的基本原理微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不
6、活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的本讲稿第十三页，共二十五页选择保藏方法时，首先应考虑方法能否长期地保持菌种原有的特性，同时也应兼顾到方法的经济和简便。在实际工作中，往往多种条件同时使用,以提高保藏效果。（二）菌种保藏步骤挑选特征典型的纯菌菌落；确定保藏的合适菌体形态；选择最适宜的保藏方法；定期对保藏菌种进行检查，观察是否发生变化，若有变化，须改变保藏方法。保藏期满应及时进行移种。本讲稿第十四页，共二十五页1.1.琼脂斜面低温保存法琼脂斜面低温保存法（
7、1）方法：将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种用牛皮纸保好，为减缓培养基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏管的棉花塞换成橡胶塞。放在4左右的冰箱中保藏。每隔23个月移种一次，继续进行保藏。若用半固体高层培养基穿刺培养，一般可保藏半年 一年。有的甚至更长时间。（2）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。本讲稿第十五页，共二十五页大肠杆菌斜面大肠杆菌斜面 金黄色葡萄球菌斜面金黄色葡萄球菌斜面本讲稿第十六页，共二十五页各类菌种保藏条件及时间各类菌种保藏条件及时间菌菌 种种培培 养养 基基保存温保存温度度传传 种
8、种 时时 间间细细 菌菌一一般般多多用用于于营营养养琼琼脂脂或或根根据据菌菌种种规规定定选选用用培养基培养基46芽芽孢孢杆杆菌菌36个个月月，其它细菌每个月其它细菌每个月酵母菌酵母菌一一般般用用麦麦芽芽汁汁琼琼脂脂或或麦芽汁酵母膏琼脂麦芽汁酵母膏琼脂46一般一般46个月个月丝状真丝状真菌菌一般用PDA琼脂、蔡氏琼脂或麦芽汁琼脂等46每每4个个月月移移植植一一次次（每每2个月移植一次个月移植一次）本讲稿第十七页，共二十五页（3）特点：优点是简便，易于推广；一般不需要另选择保藏用培养基；对大多数微生物都适用。缺点是保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染。本讲稿第十八页，共二十五页（4）注意事项：
9、）注意事项：保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霉，如有异常应及时处理。每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培养基特征和纯度无误后再继续保藏。保藏菌种的培养基应无糖，其他菌类含糖小于2%为宜，以免产酸过多，影响菌种存活。铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，不宜用本法保存。本讲稿第十九页，共二十五页2、液体石蜡保存法、液体石蜡保存法：本法是用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的
10、保藏期。（1）方法：将菌种接种于斜面或穿刺于0.30.5%琼脂半固体高层培养基中，培养好备用。取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管1015ml，加棉塞，瓶口包上纸，121高压灭菌30min，取出置37温箱或110170烤箱中12h或干燥器内除去液体石蜡中的水分。本讲稿第二十页，共二十五页将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内，液体石蜡液面以高出培养基最上端1为宜，将试管直立，放入4冰箱中保藏。适用范围：适用于保藏部分霉菌，酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果较差。本讲稿第二十一页，共二十五页液体石蜡对各类菌种保藏效果液体石蜡对各类菌种保藏效果菌菌 种种菌株数菌株数保存时间（年）保存时间（年）存活率（存活
11、率（%）细菌细菌霉菌霉菌酵母菌酵母菌放线菌放线菌87586400380552420.983.688.991.3本讲稿第二十二页，共二十五页（3）特点：）特点：本方法简便易行，是实验室常用的一种保藏方法，该法主要使菌种与空气隔绝。（4）注意事项：）注意事项：保藏时，用新鲜培养物接种，应检查纯度和特征 后，方可进行保藏。保藏过程中，需经常观察斜面是否干燥，如干燥，需重新移种。使用菌种时，先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一边，再用接种针挑取培养物接种到新鲜斜面上培养，待长出新培养物后，再移种一次到新斜面上即可使用。本讲稿第二十三页，共二十五页将沾有少量液体石蜡的接种针浸于95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接在酒精灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染。液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度要严格控制，如太多，会影响菌种交换气体，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，将缩短保藏期。一般以高出斜面1为宜。制备无菌液体石蜡时，每管装量不能太多，否则分装到菌种培养基中易造成污染。本讲稿第二十四页，共二十五页本讲稿第二十五页，共二十五页