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1、第三章基因工程载体第三章基因工程载体第1页，共85页，编辑于2022年，星期二定义：在基因工程操作中，把能定义：在基因工程操作中，把能携带外源携带外源DNA进入受体细胞的进入受体细胞的DNA分子分子叫载体。叫载体。1.载体载体（Vectors）多克隆位点多克隆位点多克隆位点多克隆位点(multiple cloning site)(multiple cloning site)oriori复制起始点复制起始点复制起始点复制起始点遗传标记遗传标记遗传标记遗传标记pUCpUCMCSMCSAmpAmpr r第2页，共85页，编辑于2022年，星期二（1）在宿主细胞内能独立复制，在宿主细胞内能独立复制，o
2、ri。（3）多克隆位点：多克隆位点：外源基因插入的外源基因插入的单一单一限制酶位点。限制酶位点。2.基因工程对载体的要求基因工程对载体的要求（7）具有较好的安全性，不能任意转移具有较好的安全性，不能任意转移。（2）有选择性标记有选择性标记 Ampr、Tetr、Kanr等等。（4）分子量小，分子量小，可容纳较大的外源基因片段。可容纳较大的外源基因片段。（5）拷贝数多，拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。方便外源基因在细胞内大量扩增。（6）具有对受体细胞的可转移性具有对受体细胞的可转移性。第3页，共85页，编辑于2022年，星期二载体载体 的种类的种类 基因工程中常用的载体有基因工程中常用的载
3、体有5类：类：质粒（质粒（plasmid）单链单链DNA噬菌体噬菌体M13 噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物 柯斯质粒（柯斯质粒（cosmid）动物病毒（动物病毒（virus）第4页，共85页，编辑于2022年，星期二第一节第一节 质粒载体质粒载体 一、质粒（一、质粒（plasmid）独立于染色体以外的能独立于染色体以外的能自主复制自主复制的双链闭合环状的双链闭合环状DNA分分子子（Covalently Closed Circular DNA,ccc DNA）。并不是细胞生长所必需的，但可以赋予细胞某些抵御并不是细胞生长所必需的，但可以赋予细胞某些抵御外界环境因素不利影响的能力外界环境因素不利影响
4、的能力，如抗生素抗性、对重金，如抗生素抗性、对重金属离子的抗性、分泌细菌毒素等。属离子的抗性、分泌细菌毒素等。分子量在分子量在1-500kb之间之间广泛存在于细菌。广泛存在于细菌。第5页，共85页，编辑于2022年，星期二第6页，共85页，编辑于2022年，星期二p氯霉素扩增：氯霉素扩增：在抑制蛋白合成并阻断细菌染色体复制在抑制蛋白合成并阻断细菌染色体复制在抑制蛋白合成并阻断细菌染色体复制在抑制蛋白合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素存在时，的氯霉素存在时，的氯霉素存在时，的氯霉素存在时，松弛型松弛型质粒可继续扩增，其拷贝数质粒可继续扩增，其拷贝数可达可达2000-30002000-3000个，个
5、，个，个，称氯霉素扩增效应称氯霉素扩增效应二、质粒（二、质粒（plasmid）的基本特征）的基本特征1 1、自主复制性、自主复制性、自主复制性、自主复制性 ：质粒质粒DNA携带携带复制起始区复制起始区复制起始区复制起始区（ori）以及一个以及一个以及一个以及一个控制质粒拷贝数控制质粒拷贝数的基因，因此的基因，因此能独立于宿主细胞的染色体能独立于宿主细胞的染色体能独立于宿主细胞的染色体能独立于宿主细胞的染色体DNADNA而自主复制。而自主复制。而自主复制。而自主复制。松弛型复制质粒（松弛型复制质粒（松弛型复制质粒（松弛型复制质粒（relaxed plasmid relaxed plasmid）:
6、在整个细胞在整个细胞在整个细胞在整个细胞周期中随时可以复制，每个细胞中有许多拷贝周期中随时可以复制，每个细胞中有许多拷贝,一般一般一般一般10-60 10-60 拷贝拷贝拷贝拷贝，如如如如Col E1Col E1质粒。质粒。质粒。质粒。第7页，共85页，编辑于2022年，星期二严紧型复制质粒严紧型复制质粒（stringent plasmid）：）：只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制复制时，它也不能复制，通常每个细胞通常每个细胞通常每个细胞通常每个细胞内只含有内只含有内只含有内只含有1个或个或几个质粒分子（几个质粒分子（1-3
7、拷贝）拷贝）拷贝）拷贝），如如如如pSC101。2、可转移性：、可转移性：在天然条件下，很多天然质粒在天然条件下，很多天然质粒都可通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转都可通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的上的mob基因基因产物。产物。第8页，共85页，编辑于2022年，星期二n n基因工程一般只能利用基因工程一般只能利用基因工程一般只能利用基因工程一般只能利用非接接合型质粒，非接接合型质粒，保证分子操作保证分子操作保证分子操作保证分子操作过程中质粒在细胞中的稳定性。过程中质粒在细胞中的稳定性。过程中质粒在细胞中的稳定
8、性。过程中质粒在细胞中的稳定性。n n结合型质粒：结合型质粒：结合型质粒：结合型质粒：相对分子质量大、拷贝数小、相对分子质量大、拷贝数小、相对分子质量大、拷贝数小、相对分子质量大、拷贝数小、严紧型复制严紧型复制严紧型复制严紧型复制n n非结合型质粒：非结合型质粒：非结合型质粒：非结合型质粒：相对分子质量小、拷贝数多、松弛型复制相对分子质量小、拷贝数多、松弛型复制相对分子质量小、拷贝数多、松弛型复制相对分子质量小、拷贝数多、松弛型复制n nConjugative plasmid 接合型质粒（自我转移的接合型质粒（自我转移的质粒）：质粒）：质粒）：质粒）：质粒可从一个细胞自发转移到另一个细胞。质粒
9、可从一个细胞自发转移到另一个细胞。n nNon Conjugative plasmid 非接合型质粒非接合型质粒（不能自我转移的质粒）：（不能自我转移的质粒）：（不能自我转移的质粒）：（不能自我转移的质粒）：由于失去控制细菌配对和自由于失去控制细菌配对和自我转移的基因，质粒不能从一个细胞自发的转移到另我转移的基因，质粒不能从一个细胞自发的转移到另一个细胞。一个细胞。第9页，共85页，编辑于2022年，星期二 在没有选择压力的情况下，在没有选择压力的情况下，在没有选择压力的情况下，在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的两种亲缘关系密切的不同质粒不同质粒，不能不能不能不能在同一个寄主细胞系中稳
10、定地共在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞增殖过程中，存的现象。在细胞增殖过程中，存的现象。在细胞增殖过程中，存的现象。在细胞增殖过程中，其中必有一种会被其中必有一种会被其中必有一种会被其中必有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。逐渐地排斥（稀释）掉。逐渐地排斥（稀释）掉。逐渐地排斥（稀释）掉。3.质质粒的不相容性粒的不相容性(incompatibility,又称不亲和性又称不亲和性)：不亲和群（不亲和群（不亲和群（不亲和群（incompatibility group)incompatibility group)：指具有亲缘关系，但彼此之间是互不相容的质粒。指具有亲缘关系，但彼此之间是互不相
11、容的质粒。基因工程中，作为受体的细胞最好不含内源质粒。基因工程中，作为受体的细胞最好不含内源质粒。第10页，共85页，编辑于2022年，星期二第11页，共85页，编辑于2022年，星期二4、携带特殊的遗传标记：、携带特殊的遗传标记：野生型的质粒野生型的质粒DNA上往往上往往携带一个或多个携带一个或多个遗传标记基因遗传标记基因，这使寄主生，这使寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性：抗生素、重金属、毒性阴离子等物质抗性：抗生素、重金属、毒性阴离子等物质合成物质合成:细菌毒素、有机碱细菌毒素、有机碱Amp、Cm、Kan、Tet、Sm显性质粒显性质
12、粒dominant plasmid、隐蔽质粒隐蔽质粒concealed palsmid这些标记基因对这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义重组分子的筛选具有重要意义第12页，共85页，编辑于2022年，星期二5.5.根据基因工程的特殊要求加装根据基因工程的特殊要求加装根据基因工程的特殊要求加装根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件特殊的基因元件三、质粒载体的构建三、质粒载体的构建1、质粒构建基本策略质粒构建基本策略1.1.加入合适的选择标记基因，加入合适的选择标记基因，加入合适的选择标记基因，加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于选择转化如两个以上，易于选择转化如两个以上，易于选择
13、转化如两个以上，易于选择转化体体体体2.增加或减少合适的酶切位点，便于重组增加或减少合适的酶切位点，便于重组3.3.缩短长度，缩短长度，缩短长度，缩短长度，提高导入效率，增加装载量提高导入效率，增加装载量4.4.改变复制子改变复制子，变严紧为松弛变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝变少拷贝为多拷贝第13页，共85页，编辑于2022年，星期二第14页，共85页，编辑于2022年，星期二7 7、达到预期目的前提下，构建过程应力求简单、达到预期目的前提下，构建过程应力求简单、达到预期目的前提下，构建过程应力求简单、达到预期目的前提下，构建过程应力求简单2.质粒构建原则质粒构建原则1 1、选择合适的、选择合
14、适的、选择合适的、选择合适的出发质粒出发质粒出发质粒出发质粒:Ori、选择标记、选择标记、选择标记、选择标记、MCSMCS2 2、正确获得构建、正确获得构建、正确获得构建、正确获得构建质粒载体的元件：酶切、质粒载体的元件：酶切、质粒载体的元件：酶切、质粒载体的元件：酶切、PCR3 3、组装合适的、组装合适的、组装合适的、组装合适的选择标记基因选择标记基因4 4、选择、选择、选择、选择合适的启动子合适的启动子5 5、提高、提高、提高、提高外源外源外源外源DNA的容量的容量的容量的容量6 6、需要、需要、需要、需要灭活灭活灭活灭活出发质粒上的某些出发质粒上的某些出发质粒上的某些出发质粒上的某些编码
15、基因编码基因编码基因编码基因第15页，共85页，编辑于2022年，星期二3.3.质质粒粒载载体的体的类类型型（1）高拷贝数的质粒载体）高拷贝数的质粒载体ColE1ColE1、pMB1pMB1、pMB9pMB9为松弛性质粒。为松弛性质粒。具有低分子量、高拷贝数的优点。具有低分子量、高拷贝数的优点。具有氯霉素扩增效应：每个细胞的拷贝数具有氯霉素扩增效应：每个细胞的拷贝数1000100030003000个！个！用途：用途：适合大量增殖克隆基因适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的、或需要表达大量的基因产物。基因产物。第16页，共85页，编辑于2022年，星期二（2）低拷贝数的质粒载体）低拷贝数的质粒
16、载体由由pSC101派生来的载体。派生来的载体。特点是拷贝数低。特点是拷贝数低。pLG338、pLG339等等适合于适合于克隆含量过高克隆含量过高对寄主代谢有害的基因。对寄主代谢有害的基因。减少蛋白质产物对寄主细胞的毒害。减少蛋白质产物对寄主细胞的毒害。（3）失控的质粒载体）失控的质粒载体一些低拷贝基因是温度敏感型，一些低拷贝基因是温度敏感型，如如pBEU1、pBEU2温度低温度低（40 oC），拷贝数很快增加到，拷贝数很快增加到1000个。个。第17页，共85页，编辑于2022年，星期二（4）插入失活型质粒载体插入失活型质粒载体 载体的克隆位点位于其载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内
17、部某一个选择性标记基因内部。外源外源DNA片段插入会导致选择记号基因（如片段插入会导致选择记号基因（如tetr、ampr、cmr等）失活。等）失活。如如pDF41、pDF42、pBR322。抗生素抗性抗生素抗性外源外源DNA无抗生素抗性无抗生素抗性第18页，共85页，编辑于2022年，星期二（5）正选择的质粒载体正选择的质粒载体 Direct selection vectors可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而减轻可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而减轻实验的工作量，提高了选择的敏感性。实验的工作量，提高了选择的敏感性。质粒载体具有质粒载体具有直接选择记号直接选择记号并赋予寄主细胞并赋予
18、寄主细胞相应的表型相应的表型。只有只有带有选择标记基因带有选择标记基因的转化菌细的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。胞才能在选择培养基上生长。第19页，共85页，编辑于2022年，星期二（6）表达型质粒载体表达型质粒载体含有强的含有强的启动基因启动基因，合适的顺序合适的顺序以及有效的以及有效的终止子终止子，以便外源基因在受体细胞内的高效表达。以便外源基因在受体细胞内的高效表达。主要用来使主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。外源基因表达出蛋白质产物。使克隆在特定位点的使克隆在特定位点的外源基因置于大肠杆菌的外源基因置于大肠杆菌的转录转录-翻译信号控制下，翻译信号控制下，并能在细胞中正常并能在细胞
19、中正常转录转录并转译成相应蛋白质并转译成相应蛋白质的载体。的载体。第20页，共85页，编辑于2022年，星期二大肠杆菌表达型质粒载体大肠杆菌表达型质粒载体的的的的结构结构第21页，共85页，编辑于2022年，星期二四、经典的大肠杆菌质粒载体四、经典的大肠杆菌质粒载体1.pSC101天然质粒，属天然质粒，属严紧型低拷贝严紧型低拷贝质粒。质粒。9.09 kb。四环。四环素抗性素抗性Tetr。2.克隆位点克隆位点第22页，共85页，编辑于2022年，星期二第23页，共85页，编辑于2022年，星期二2.ColE1天然质粒，属天然质粒，属松弛型松弛型、高拷贝高拷贝质粒，质粒，6.3Kb。选择标记选择标
20、记大肠杆菌素（大肠杆菌素（colicin）E1和和对对E1免疫的基因免疫的基因（immE1）有氯霉素扩增效应，每个细胞有氯霉素扩增效应，每个细胞1000-30001000-3000拷贝拷贝pcolicin E1能杀死能杀死不含不含ColE1 质粒的菌质粒的菌。第24页，共85页，编辑于2022年，星期二 colicin E1基因的结构基因的结构ceaimmkil结构基因结构基因免疫基因免疫基因溶菌基因溶菌基因 杀死不含有杀死不含有ColE1细菌的原因细菌的原因cea+kil基因产物基因产物 不被其他细菌的不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因所杀死的原因imm基因基因第25页，共85页
21、，编辑于2022年，星期二EcoR I位于位于E1内部，内部，插入外源插入外源DNA导致导致E1失失活，使受体菌不能合成活，使受体菌不能合成E（ColE1-），但仍表现，但仍表现出对出对E1免疫型免疫型（ImmE1+）。EcoR I克隆位点克隆位点Colicin E1外源外源DNA无无Colicinl用对外源用对外源colicin E1的免疫性和自身不能合成的免疫性和自身不能合成colicin E1作选择，操作非常繁杂。作选择，操作非常繁杂。第26页，共85页，编辑于2022年，星期二3.pBR322：p:p:质粒；质粒；BRBR：质粒两位主要质粒两位主要构建者姓氏的第一个字构建者姓氏的第一个
22、字母；母；322322：实验编号实验编号人工构建载体人工构建载体三个亲本质粒：三个亲本质粒：pMB1:出发质粒出发质粒(ColE1)pSF2124:AmprpSC101:TetrpSF2124pMB1pSC101第27页，共85页，编辑于2022年，星期二氨苄青霉素和四环素抗性氨苄青霉素和四环素抗性24个单一克隆位点。个单一克隆位点。9个导致个导致Tetr基因失活基因失活3个会导致个会导致Ampr基因失活基因失活第28页，共85页，编辑于2022年，星期二pBR322的优点的优点 双抗生素抗性选择标记双抗生素抗性选择标记 抗生素抗性基因的插入失活效应是检测重组体抗生素抗性基因的插入失活效应是检
23、测重组体质粒的有效方法，质粒的有效方法，分两次先后选择：分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞没有获得载体的寄主细胞 在在Amp或或Tet中中都都死亡。死亡。获得获得重组载体重组载体的寄主细胞的寄主细胞 在在Amp或或Tet其中之一其中之一中死亡。中死亡。第29页，共85页，编辑于2022年，星期二第30页，共85页，编辑于2022年，星期二AmpAmpAmpAmpTetTet不含质粒载体不含质粒载体含有空质粒载体含有空质粒载体含有重组质粒载体含有重组质粒载体第31页，共85页，编辑于2022年，星期二氯霉素扩增之后，每个细胞可达氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copies 安全安
24、全失去了转移蛋白基因失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过。不能通过接合转移。接合转移。高拷贝数高拷贝数 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大长度长度4363bp，易于纯化，可以携带，易于纯化，可以携带6-8Kb的外源的外源DNA片段。片段。具有较多的单一酶切位点（具有较多的单一酶切位点（24种）种）第32页，共85页，编辑于2022年，星期二4.pUC系列系列 在在pBR322的基础上改造而成。属的基础上改造而成。属正选择载体。正选择载体。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19第33页，共85页，编辑于2022年，星期二第34页，
25、共85页，编辑于2022年，星期二（1）元件来源）元件来源c.lacz基因：基因：大肠杆菌大肠杆菌lac操纵子操纵子DNA区段，编码区段，编码-半半乳糖苷酶乳糖苷酶-肽链肽链，是，是LacZ氨氨基端基端的一个片段的一个片段.载体用于可编码半乳糖苷酶载体用于可编码半乳糖苷酶羧基端羧基端部分序列的宿主细胞。部分序列的宿主细胞。a.ori来自来自pBR322质粒的复制起点质粒的复制起点b.标记基因（标记基因（ampr）:pBR322的的Ampr基因基因 第35页，共85页，编辑于2022年，星期二（2）克隆位点）克隆位点 具有具有MCS（多克隆位点）区段：位于（多克隆位点）区段：位于lacZ基因的基
26、因的5端。端。10个连续的单一限制酶切位点，但它不破坏该基个连续的单一限制酶切位点，但它不破坏该基 因功能。因功能。第36页，共85页，编辑于2022年，星期二n IPTGIPTG：异丙基异丙基-D-D-硫代半乳糖苷，乳糖类似硫代半乳糖苷，乳糖类似物，又称为物，又称为安慰诱导物安慰诱导物，可代替，可代替乳糖乳糖诱导乳糖诱导乳糖操纵子结构基因的表达，即可诱导操纵子结构基因的表达，即可诱导laczlacz所编所编码的半乳糖苷酶码的半乳糖苷酶氨基末端片段（氨基末端片段（肽）肽）的合成的合成。n x-galx-gal：5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-D-D-半乳糖苷，半乳糖苷，为为生色底
27、物，生色底物，半乳糖苷酶半乳糖苷酶+x-gal+x-gal 蓝色蓝色v菌落蓝白选择菌落蓝白选择的原理：的原理：第37页，共85页，编辑于2022年，星期二-互补：互补：pUC类载体带有类载体带有lacz基因，编码半乳糖苷酶基因，编码半乳糖苷酶氨氨基端片段基端片段（-肽）肽），此片段与宿主细胞所编码的，此片段与宿主细胞所编码的羧基端羧基端半乳糖苷酶半乳糖苷酶实现基因内互补，实现基因内互补，形成有功能的半乳糖苷酶，形成有功能的半乳糖苷酶，称称-互补互补。菌落蓝白选择的原理：菌落蓝白选择的原理：第38页，共85页，编辑于2022年，星期二IPTGIPTG蓝色菌落蓝色菌落5-5-5-5-溴溴溴溴-4-
28、4-4-4氯氯氯氯-靛蓝靛蓝靛蓝靛蓝 第39页，共85页，编辑于2022年，星期二菌落蓝白菌落蓝白斑选择的原理：斑选择的原理：斑选择的原理：斑选择的原理：在基因克隆时，细菌在含有在基因克隆时，细菌在含有IPTGIPTG和和x xgalgal的培养基的培养基中进行培养。中进行培养。IPTGIPTGIPTGIPTG诱导质粒的诱导质粒的诱导质粒的诱导质粒的laczlacz基因产生基因产生-肽，肽，同时诱导细菌产生半乳糖苷酶的羧基端片段。两种片段同时诱导细菌产生半乳糖苷酶的羧基端片段。两种片段形成有功能的半乳糖苷酶，从而使形成有功能的半乳糖苷酶，从而使xgal水解，产生水解，产生蓝色物质，使非重组菌落
29、呈现蓝色。蓝色物质，使非重组菌落呈现蓝色。当外源基因当外源基因插到质粒的多克隆位点后，使插到质粒的多克隆位点后，使laczlaczlaczlacz失活，不能表达失活，不能表达失活，不能表达失活，不能表达-肽，肽，破坏了互补作用，细胞内无破坏了互补作用，细胞内无有活性半乳糖苷酶，使有活性半乳糖苷酶，使带有重组质粒带有重组质粒带有重组质粒带有重组质粒的细菌将产生的细菌将产生白色菌落。白色菌落。第40页，共85页，编辑于2022年，星期二PUCPUC载体的优点：载体的优点：a a 具有具有更小的相对分子质量更小的相对分子质量和更和更高的拷贝数，高的拷贝数，平均每个细胞可达平均每个细胞可达500-70
30、0500-700个拷贝个拷贝b 具有具有MCS片段片段，可把具有两种不同粘性末，可把具有两种不同粘性末端的外源端的外源DNA片段直接克隆到片段直接克隆到pUC类载体上。类载体上。c 可以用可以用组织化学方法组织化学方法检测重组体检测重组体.第41页，共85页，编辑于2022年，星期二3.3.EB浓度达到饱和时，浓度达到饱和时，超螺旋超螺旋质粒质粒DNADNA分子密度分子密度大于大于线形和开环线形和开环的质粒的质粒DNADNA，从而分开。，从而分开。五、质粒的分离纯化五、质粒的分离纯化P60原理原理1.CsCl密度梯度离心法原理密度梯度离心法原理1.EB能够嵌入能够嵌入DNA的碱基对之间，的碱基
31、对之间，不同构型不同构型DNA分子结合分子结合EB的量不同，从而密度不同。的量不同，从而密度不同。2.完整的完整的超螺旋质粒超螺旋质粒没有自由末端没有自由末端,解链比较困解链比较困 难难，结合结合EB的量少的量少，密度较大密度较大.线形的线形的DNA和开环和开环的质粒的质粒DNA由于松弛，可以由于松弛，可以 结合结合较多的较多的EB分子，分子，则密度小则密度小.第42页，共85页，编辑于2022年，星期二用含有用含有EDTAEDTA的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体加加溶菌酶溶菌酶裂解细菌细胞壁裂解细菌细胞壁加入含加入含EBEB的的CsClCsCl中中超速离心超速离心在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取
32、cccDNAcccDNA 并稀释沉淀并稀释沉淀cccDNAcccDNACsCl密度梯度离心基本步骤密度梯度离心基本步骤质粒质粒DNA纯度高、周期长、纯度高、周期长、设备要求高、设备要求高、EB污染污染第43页，共85页，编辑于2022年，星期二（1 1）加加溶菌酶溶菌酶溶菌酶溶菌酶破细胞壁破细胞壁（2 2）将菌体悬浮在含有）将菌体悬浮在含有EDTAEDTA和和Triton X-100Triton X-100的缓冲液的缓冲液中，中，溶解细胞膜溶解细胞膜。（3 3）放入）放入沸水浴沸水浴沸水浴沸水浴中煮中煮中煮中煮40404040秒，秒，秒，秒，使使使使蛋白质变性蛋白质变性 。（4 4）离心，）离
33、心，变性蛋白带着染色体变性蛋白带着染色体DNADNA一起沉淀下来，质一起沉淀下来，质粒粒DNADNA仍留在上清液中。仍留在上清液中。（5 5 5 5）异丙醇沉淀，乙醇洗涤。）异丙醇沉淀，乙醇洗涤。）异丙醇沉淀，乙醇洗涤。）异丙醇沉淀，乙醇洗涤。2、沸水浴法、沸水浴法3.碱裂解法碱裂解法制备的质粒不纯，收率低，制备规模小，但快速，制备的质粒不纯，收率低，制备规模小，但快速，特别适用小量提取质粒。特别适用小量提取质粒。第44页，共85页，编辑于2022年，星期二第二节第二节 噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA组成组成组成组成：蛋白质、蛋白质、核酸核酸.结构：结构：结构：结构：蛋白质外壳蛋白质外壳、尾巴
34、尾巴尾尾尾尾巴巴巴巴上上上上的的的的微微丝丝可可可可以以以以把把把把噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体的的的的DNADNADNADNA注入细菌内。注入细菌内。注入细菌内。注入细菌内。是比细菌还小得多的微生物，是比细菌还小得多的微生物，噬菌体侵犯细菌，可以认为它噬菌体侵犯细菌，可以认为它是细菌里的是细菌里的“寄生虫寄生虫”。Bacteriophage(phage)第45页，共85页，编辑于2022年，星期二一、大肠杆菌的一、大肠杆菌的-噬菌体噬菌体DNA（1）线线状双状双链链DNA，两端各有一个，两端各有一个12bp的互的互补单链补单链（粘性末端，粘性末端，cohesive-end site），称），称c
35、os site，粘性粘性末端粘连接变成末端粘连接变成环状环状DNA。（一）（一）-噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性1、由、由外壳包装蛋白外壳包装蛋白和和-DNA组成组成lcos位点是噬菌体包装必需序列。位点是噬菌体包装必需序列。2、-DNA的物理图谱的物理图谱48.5kb第46页，共85页，编辑于2022年，星期二（2）功能相近的基因在基因组中聚集在一起）功能相近的基因在基因组中聚集在一起 目前已经被确定的基因至少目前已经被确定的基因至少61种，一半为必需基因种，一半为必需基因第47页，共85页，编辑于2022年，星期二第48页，共85页，编辑于2022年，星期二u噬菌体基因大致分为噬菌体
36、基因大致分为4个区：个区：裂解区：裂解区：O-R基因基因 调控区：调控区：启动子、终止子和启动子、终止子和N、CI基因基因重组区：重组区：att（attachment）、）、int（intagrate）及及xis（excision）结构区：结构区：A J19个基因，编码个基因，编码头、头、尾部蛋白尾部蛋白质质第49页，共85页，编辑于2022年，星期二3、感染周期（溶菌循环）、感染周期（溶菌循环）DNA复制早期：一个复制早期：一个ori，双向复制，双向复制晚期：滚环复制晚期：滚环复制-多个多个DNA分子形成线状多联体分子形成线状多联体第50页，共85页，编辑于2022年，星期二 头部包装蛋白头
37、部包装蛋白首先结合在首先结合在cos区区的附近，形成的附近，形成包装包装启动复合物启动复合物，A蛋白蛋白切割切割cos位点位点。包装包装E E第51页，共85页，编辑于2022年，星期二4、溶源状态的建立、溶源状态的建立 噬菌体感染大肠杆菌后，噬菌体感染大肠杆菌后，DNA直接直接整合整合到到宿主细宿主细胞染色体胞染色体DNA上，并不裂解细胞，这种情况称为上，并不裂解细胞，这种情况称为溶溶源状态源状态。DNA重组技术一般需要噬菌体处于溶源状态。重组技术一般需要噬菌体处于溶源状态。整合主要由整合主要由cI和和int基因的产物所激活，这两个基因的开放基因的产物所激活，这两个基因的开放与关闭取决于宿主
38、细胞本身的性质。与关闭取决于宿主细胞本身的性质。cI基因：基因：编码阻遏蛋白，编码阻遏蛋白，是感染了是感染了噬菌体的寄主细胞进噬菌体的寄主细胞进入溶源化的必要条件。入溶源化的必要条件。cI基因失活或缺失基因失活或缺失的的噬菌体无法噬菌体无法使寄主细胞使寄主细胞发生溶源化发生溶源化效应。效应。第52页，共85页，编辑于2022年，星期二噬菌体基因组可以整合到大肠杆菌染色体噬菌体基因组可以整合到大肠杆菌染色体DNA上，上，成为成为原噬菌体原噬菌体。适当条件下，原噬菌体又可以脱离寄主染色体，重新变成适当条件下，原噬菌体又可以脱离寄主染色体，重新变成独立的复制子，这种过程叫做独立的复制子，这种过程叫做
39、原噬菌体的删除作用。原噬菌体的删除作用。超感染免疫性超感染免疫性 l噬菌体噬菌体DNA的整合与删除：的整合与删除：溶源性细菌，由于含有溶源性细菌，由于含有原噬菌体原噬菌体，故不能再，故不能再次被次被同种同种噬菌体感染。溶源性细菌所具有的这种噬菌体感染。溶源性细菌所具有的这种抗御抗御同种噬菌体再感染同种噬菌体再感染的特性叫做的特性叫做超感染免疫性超感染免疫性。第53页，共85页，编辑于2022年，星期二噬噬菌菌体体的的溶溶源源和和裂裂解解第54页，共85页，编辑于2022年，星期二插入型载体、取代型载体插入型载体、取代型载体（二）（二）-DNA载体的构建载体的构建u根据切除的多少，将根据切除的多
40、少，将-DNA分为两大类载体：分为两大类载体：1、缩短长度、缩短长度野生型野生型:上限上限51kb-DNA：48.5kb，外源基因，外源基因2.5kb-DNA上有上有40-50%的的DNA是复制，裂解所不必需的，是复制，裂解所不必需的，切除便提高装载量。切除便提高装载量。20kb20kb18kb18kb12kb12kb第55页，共85页，编辑于2022年，星期二第56页，共85页，编辑于2022年，星期二插入型载体（插入型载体（insertion vector）经改造后经改造后只具有只具有一个一个可供外源可供外源DNA插入的插入的克隆位点克隆位点,长度为长度为37kb，为包装的下限，它本身也能
41、被包装，允许插入片段最大为，为包装的下限，它本身也能被包装，允许插入片段最大为14kb.必须携带标记基因必须携带标记基因第57页，共85页，编辑于2022年，星期二取代型载体（取代型载体（substitution vector）具有具有成对的克隆位点成对的克隆位点,空载的载体空载的载体DNA只只26kb，不能被包装，无，不能被包装，无法进入受体细胞中去法进入受体细胞中去,不需要标记基因不需要标记基因.第58页，共85页，编辑于2022年，星期二插入型载体只能承受插入型载体只能承受较小分子量较小分子量（一般在（一般在10kb以内）的外源以内）的外源DNA片段的插入，广片段的插入，广泛应用于泛应用
42、于cDNA及小片段及小片段DNA的克隆。的克隆。u应用：应用：替换型载体可承受替换型载体可承受较大分子量较大分子量的外源的外源DNA片段的插入，所以适用于片段的插入，所以适用于克隆高等克隆高等真核生物的染色体真核生物的染色体DNA。第59页，共85页，编辑于2022年，星期二 删除重复的酶切位点删除重复的酶切位点:野生型野生型DNA链链上有上有5个个EcoRI位点和位点和7个个HindIII位点，不利于重位点，不利于重组组操作，必操作，必须删须删除至除至1-2个个.为为了便于了便于各种来源的各种来源的DNA片段的克隆，片段的克隆，还还需要需要增加增加一些一些单单一的一的酶酶切位点切位点.2、酶
43、切位点的删除或增加、酶切位点的删除或增加 采用定点突变技术或甲基化酶处理必需区采用定点突变技术或甲基化酶处理必需区内的酶识别序列使其失活。内的酶识别序列使其失活。第60页，共85页，编辑于2022年，星期二3、灭活某些与裂解周期有关的基因、灭活某些与裂解周期有关的基因 将将无义突变无义突变引入噬菌体裂解周期所需的基因引入噬菌体裂解周期所需的基因，如如将头部包装蛋白基因的将头部包装蛋白基因的CAG突变成突变成UAG。这些这些噬菌体只能在具有噬菌体只能在具有特异校正基因编码产物的特异校正基因编码产物的菌株内菌株内繁殖。繁殖。当这种当这种DNA进入一般大肠杆菌菌株后，不能合进入一般大肠杆菌菌株后，不
44、能合成成有活性的头部蛋白有活性的头部蛋白，也就，也就不能被包装和裂解细不能被包装和裂解细菌菌，可阻止有害重组体的生物污染及扩散。，可阻止有害重组体的生物污染及扩散。基因工程实验中使用的受体是具有基因工程实验中使用的受体是具有琥珀型突变体校琥珀型突变体校正功能正功能的菌株。的菌株。第61页，共85页，编辑于2022年，星期二4、加装选择标记、加装选择标记 野生型野生型-DNA上缺少合适的选择标记，因此加上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是装选择标记是-DNA克隆载体构建的重要内容。克隆载体构建的重要内容。选择标记主要有两类：选择标记主要有两类：l免疫功能类标记免疫功能类标记l颜色反应类标记颜
45、色反应类标记第62页，共85页，编辑于2022年，星期二(1)(1)免疫功能失活标记免疫功能失活标记(cI(cI筛选筛选)l 加装选择标记加装选择标记cI基因基因lcI基因基因编码一种编码一种阻止阻止-噬菌体噬菌体进进入入溶菌循溶菌循环环的阻遏物。的阻遏物。l含有完整含有完整标记标记基因的基因的-载载体体进进入受入受体体细细胞后，建立胞后，建立溶源状溶源状态态，细细菌生菌生长缓长缓慢，慢，形成混形成混浊浊斑斑；当当外源外源DNA插入插入到标记基因中，到标记基因中，基因灭活，基因灭活，-重组分子便进入重组分子便进入溶菌循环，溶菌循环，形成形成透明斑。透明斑。第63页，共85页，编辑于2022年，
46、星期二(2)(2)加装选择标记加装选择标记lacZlacZ（蓝白斑筛选）蓝白斑筛选）l lacZ基因编码基因编码-半乳半乳糖苷酶，糖苷酶，能催化无色的能催化无色的X-gal生成生成蓝色化合物蓝色化合物。当外源基因插入到当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，基因中，基因灭活，不能不能合成合成蓝色化合物蓝色化合物；而空载体而空载体-DNA则产则产生生蓝色透明斑蓝色透明斑。第64页，共85页，编辑于2022年，星期二5、建立、建立-噬菌体的体外包装系统噬菌体的体外包装系统体外包装原理：体外包装原理：噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。头部基因头部基因发生了发
47、生了突变突变的噬菌体只能的噬菌体只能形成尾部和头部蛋形成尾部和头部蛋白所需的蛋白因子白所需的蛋白因子；将这两种突变型的噬菌体的将这两种突变型的噬菌体的提取物混合起来，提取物混合起来，便便能够在能够在体外装配成有生物活性体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。的噬菌体颗粒。尾部基因尾部基因发生了发生了突变突变的噬菌体则只能形成的噬菌体则只能形成头部和头部和尾部蛋白所需的蛋白因子。尾部蛋白所需的蛋白因子。第65页，共85页，编辑于2022年，星期二第66页，共85页，编辑于2022年，星期二（三）（三）（三）（三）-DNA-DNA作为载体的优点作为载体的优点作为载体的优点作为载体的优点可在可在体外包装体
48、外包装成噬菌体颗粒，成噬菌体颗粒，高效转染高效转染大肠杆菌大肠杆菌-DNA载体的装载能力为载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒，远远大于质粒的装载量重组的装载量重组-DNA分子的分子的筛选较为方便筛选较为方便重组重组-DNA分子的分子的提取比质粒容易提取比质粒容易.-DNA载体适合载体适合克隆和扩增外源克隆和扩增外源DNA片段片段，常用于，常用于 构建基因文库构建基因文库缺点：缺点：缺点：缺点：(1)(1)需要包装比较麻烦，包装率又不稳定，购买包装蛋白的费需要包装比较麻烦，包装率又不稳定，购买包装蛋白的费需要包装比较麻烦，包装率又不稳定，购买包装蛋白的费需要包装比较麻烦，包装率又不稳定，购
49、买包装蛋白的费用又高；用又高；用又高；用又高；(2)(2)没有质粒的用途广泛。没有质粒的用途广泛。没有质粒的用途广泛。没有质粒的用途广泛。第67页，共85页，编辑于2022年，星期二（一）（一）柯柯斯质粒的构建斯质粒的构建考斯质粒：考斯质粒：一类人工构建一类人工构建的含有的含有DNA两端两端cos序序列列和和质质粒复制子粒复制子的特殊的特殊类类型的型的载载体。体。二、柯斯质粒（二、柯斯质粒（cosmid）组成：组成：抗性标记、质粒复制抗性标记、质粒复制起始部位、限制型内切酶切起始部位、限制型内切酶切位点、位点、cos粘性末端粘性末端第68页，共85页，编辑于2022年，星期二（二）柯斯质粒的特
50、点（二）柯斯质粒的特点1、具有具有噬菌体的特性。噬菌体的特性。具有具有cos位点位点，能像，能像-DNA一样一样体外包装体外包装，并高效导入受体细胞。，并高效导入受体细胞。2、具有质粒载体的持性。具有质粒载体的持性。可以在受体细胞内可以在受体细胞内 自由复制。自由复制。3、具有高容量的克隆能力。具有高容量的克隆能力。可以装载比质粒或可以装载比质粒或-DNA大得多的外源大得多的外源DNA片段，片段，40kb。4、便于筛选：便于筛选：携带质粒的选择标记携带质粒的选择标记。5、便于克隆：便于克隆：有质粒上的多种单一酶切位点。有质粒上的多种单一酶切位点。6、不能体内包装，不裂解受体细胞不能体内包装，不